SEP SNEST DGEST
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
PRÁCTICA N.3:
PREPARACIÓN DE
MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
Que Presentan
Rosalina García Suárez 08930339
Yactivany Atanasio Serrano 08930340
Esbeide de Paz Leonides 08930371
Víctor Manuel Vargas torres 08930311
Bellanira Pineda Pineda
08930130
Lic. Biología
Ciudad Altamirano, Gro. México.
Marzo del 2012
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CD. ALTAMIRANO
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
PRÁCTICA No.3.
PREPARACIÓN
DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
RESUMEN
La presente práctica se
realizó, en el laboratorio de microbiología, localizado en el Instituto
Tecnológico de Cd Altamirano. La cual se forjo como objetivo preparar un medio
de cultivo MS para cultivo de explantes vegetales. Se preparó un medio de
cultivo que
contuviera los nutrientes
necesarios para permitir el crecimiento de explantes,
por tal motivo para la preparación de este se adhirieron al preparado, 3.5ml de
cada una de soluciones stock (Nitratos, Sulfatos, Quelatos, PoBoMo, Alógenos y
Orgánicos), así
mismo se le incorporaron 10.5g de phytagel y 1.05g sacarosa, los cuales fueron
aforados a un volumen de 350ml. Obteniendo como resultado un medio de cultivo
MS (Murasshine y Skoog), con las
características necesarias para el desarrollo adecuado de explantes vegetales.
Palabras
clave: Medio de cultivo Murasshine y Skoog, phytagel, sacarosa, pH, probeta.
ABSTRACT
This
practice was held in the microbiology laboratory, located en el Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano. Forged which aimed at preparing an MS
medium for plant explant culture. Was prepared in a culture medium containing
the necessary nutrients to allow growth of explants, as such for the
preparation of this adhered to prepared, 3.5ml of each stock solutions
(nitrates, sulphates, chelates, PoBoMo, halogen and organic), also were
incorporated into Phytagel 1.05g and 10.5g sucrose, were filled to a volume of
350ml. Which resulted in a MS medium (Murasshine
and Skoog) with the
characteristics necessary for the proper development of plant explants.
Keywords: Culture medium Murasshine and Skoog, Phytagel, sucrose, pH probe.
ÍNDICE
PÁGINA.
1. Antecedentes……………………………………………………………………………..5
2. Definición del
problema………………………………..……………………………….6
3. Objetivos…………………………………………………………………………………..7
3.1. Objetivo general……………………………………….…………………………..…7
3.2. Objetivo específico…………………………………………………………………...7
4. Justificación…………………………………………..…………………………………..8
5. Fundamento
teórico…………………….…………..…………………………………...9
5.1. Medio de
cultivo……...……………………………………………………………….9
5.2. Tipos de medios de cultivos…………………………………..………………….....9
5.3. Clasificación por
el uso de los medios de cultivos……..…………………………9
5.4. Para la preparación se deben tener
en cuenta los siguientes aspectos..........10
6. Materiales y
métodos………………………………………………………………..…11
6.1. Cálculos para realizar
el medio de cultivo a base de soluciones stock……....11
6.2. Calibrado y pesado de la sacarosa y
phytagel………………………………..…11
6.3. Preparación del medio de cultivo…………………………………………….……12
6.4. Vaciado y guardado del medio de
cultivo……………………………………......13
7. Resultados………………………………………………………………………….....…15
8. Conclusiones y
recomendaciones…………………………………………………..21
8.1. Conclusiones…...…………………………………………………………...………21
8.2.
Recomendaciones.…………………………………………………………..……..21
9. Fuentes consultadas………………………………………………………………..…22
I. ANTECEDENTES
|
Los medios de cultivo son una
mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos, (Pedrique de Alucio, 1992).
En
consecuencia, la nutrición orgánica de las plantas es un tema muy amplio que se
extiende desde la nutrición de bacterias y hongos, los variados requerimientos
nutricionales de partes aisladas de plantas, los requerimientos especiales de
embriones aislados, los tejidos cultivados, las células y protoplastos hasta el
tema tan discutido de las plantas superiores obtienen un beneficio especial de
las complejas sustancias orgánicas que se encuentran principalmente en el
estiércol natural y en las coberturas protectoras. Posiblemente la formación
del medio para el cultivo de tejidos es más un arte que una disciplina por
derecho público; la experiencia es el mejor maestro para este tipo de trabajo,
y este es el mejor consejo u orientación que se le puede dar a un principiante.
Se
debería trabajar con materiales que estén definidos con precisión desde el
punto de vista taxonómico, genético y del desarrollo; existen muchas evidencias
que sugieren que la variación en la respuesta al cultivo de tejidos según el
genotipo de la forma como se haga el cultivo, (Krikorian 1990).
II.
DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Para propagar plantas in vitro en un laboratorio de
tejidos vegetales es necesario formular y preparar medios de cultivo, donde
estas puedan crecer y desarrollarse. La preparación de estos conlleva una
metodología estricta, exacta y precisa con las concentraciones y cantidades de
soluciones stock liquidas o bien con los solutos. El medio nutritivo que se
debe preparar deberá estar dotado de las condiciones, nutrientes y
requerimientos exactos para asegurar de cierta forma resultados exitosos.
III. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
ü Conocer
la preparación del medio MS(Murasshine y Skoog) para el cultivo de tejidos vegetales.
3.2. Objetivos específicos
Cálculos para realizar el medio de cultivo a base de
soluciones stock
Calibrado
y pesado de la sacarosa y phytagel
Preparación
del medio de cultivo
Vaciado
y guardado del medio de cultivo
IV. JUSTIFICACIÓN
La
preparación de un medio de cultivo para tejidos vegetales es de gran
importancia, ya que es este, quien provee las condiciones y nutrientes
necesarios al explante para su crecimiento y desarrollo. El uso adecuado de un
medio de cultivo para vegetales correctamente preparado con todos y cada uno de
sus ingredientes bien medidos y adheridos, favorecerá la producción de plantas
in vitro que se requieran propagar ya que es un medio que contiene los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios para su óptimo desarrollo.
Al
llevar a cabo la presente práctica el alumno se hará acreedor de nuevos
conocimientos y experiencias en la formulación y preparación de medios, lo cual
contribuirá a su buen desempeño el día de mañana en el ámbito laboral.
V. FUNDAMENTO
TEÓRICO
5.1. Medio de cultivo
Los medios de cultivo son una mezcla
de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas
óptimas, permiten el crecimiento de los explantes vegetales.Estos medios son
esenciales en el Laboratorio de tejidos de cultivo in vitro por lo que un
control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la
exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.
(Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992.).
En los laboratorios de cultivo de
tejidos se utilizan diferentestipos de medios de cultivo que pueden ser
preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un
medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un agente
solidificantecomo el agar, la gelatina o la sílicagel. (Clavell, L.; Pedrique
de Aulacio, M. 1992.).
5.2.- Tipos de medios de cultivos
Medios
naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o
vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y
otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes, ni las
cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
Medios
definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química
Definida
cualiy cuantitativamente. Generalmente
se usan en trabajos de investigación.
(Ortega, Y; Quevedo F. 1991).
5.3.- Clasificación por el uso
de los medios de cultivos
Medios
de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo
de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos
de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del
crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren
cultivar.
Medios selectivos: son
parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y
están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.
Medios
diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de
la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de
sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas
de los microorganismos. Los medios de cultivo se pueden
preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos,
o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de
cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de
cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se
tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.
(Ortega, Y; Quevedo F. 1991).
5.4.- Para la preparación se deben tener en cuenta los
siguientes aspectos:
ü Prepararlos
sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores.
ü Que suministren productos de calidad.
ü Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad
microbiológica y físico-Química adecuada.
ü Utilizar materiales de vidrios bien lavados y enjuagados
con agua destilada o desmineralizada.
ü Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante
su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el
fabricante. (Ortega, Y; Quevedo F. 1991).
VI.
MATERIALES Y MÉTODOS
La
presente práctica se desarrolló el día 27 de febrero del presente año en el
laboratorio de microbiología,el cual se localiza dentro del instituto
tecnológico de cd Altamirano.
La
Cd. de Altamirano municipio de Pungarabato, se localiza al noroeste del estado
de Guerrero, en la región de Tierra
Caliente y en las coordenadas
geográficas 18°25’ de latitud norte y los 100°31’ y 100°43’ de longitud oeste.
Este municipio es muy caluroso al experimentar un clima de tipo Cálido Subhúmedo con lluvias en verano
y una temperatura promedio que varía de los 26 a 28 °C. Presenta una
altitud de 241 msnm y una precipitación pluvial promedio de 1000 a 1,100 mm al año.
6.1.
Cálculos para realizar el medio de cultivo a base de soluciones stock
Para
llevar a cabo la presente práctica, primero que nada el docente indico al grupo
que se debía preparar un medio nutritivo con un volumen de 350 ml, de tal forma
que cada equipo de trabajo procedió a realizar los cálculos correspondientes
para cada elemento del medio a formular. Los cálculos realizados se hicieron de
forma ordenada, primero se calculó el volumen de las soluciones stock
preparadas en la práctica anterior (nitratos, sulfatos, quelatos, PoBoMo,
Alógenos y Orgánicos) ver tabla 1. Posteriormente se realizaron los cálculos en
gramos tanto para la sacarosa como para el phytagel, que en este caso fue el
gelificante utilizado. Ver tabla 2.
Cabe
mencionar que el medio a preparar no incluyo hormonas, aunque también para
estas fueron realizados los cálculos correspondientes.
6.2. Calibrado y pesado de la sacarosa y
phytagel
Antes
de iniciar el pesado del azúcar y del gelificante se calibro la balanza
analítica, esto para realizar un pesado preciso y exacto, así mismo se
elaboraron dos pequeñas charolas de papel aluminio, sobre las cuales se
colocaron los solutos a pesar.
El
alumno encargado de realizar el pesado de los nitratos lo hizo cuidadosamente tratando
de ser lo más exacto posible, así mismo empleo los cálculos realizados anteriormente
para cada una de los elementos. El primer elemento sometido a la balanza sobre
la charola de aluminio fue la sacarosa, de la cual se pesaron 10.5g. Por
consiguiente fue puesta en ceros nuevamente la balanza analítica, se introdujo
la segunda charola de aluminio bacía, se pesó y volvió a poner en ceros la
balanza, de tal forma que se prosiguió a pesar 1.05g del gelificante phytagel. Figura
1.
6.3. Preparación del medio de cultivo
Antes
de realizar la preparación del medio de cultivo MS, se sacaron las soluciones
stock ya preparadas, se colocaron de forma ordenada sobre la mesa de trabajo,
el orden fue el siguiente: Nitratos, Sulfatos, Quelatos, PoBoMo, Alógenos y Orgánicos.
El orden de estas fue para evitar la confusión al momento de hacer la adición de
estas al vaso depresipitados.
Una
vez colocadas las botellas contenedoras de las soluciones stock sobre la mesa
de trabajo, se colocó una pipeta de vidrio exclusiva de cada de ellas, posteriormente cada equipo tomo un
vaso depresipitados con una capacidad de 500ml, al cual le fueron agregados
100ml de agua destilada, previamente medida en una probeta de plástico. Así
mismo se prosiguió a agregar 3.5ml de cada una de las soluciones madre al vaso,
haciendo uso de la pipeta individual de cada solución. Ver figura 2.
Una
vez adheridas las soluciones stock a la preparación en el vaso depresipitados,
se prosiguió a agregar la sacarosa (azúcar morena) y a disolverla, para ello se
agito cuidadosamente con una pipeta de vidrio hasta disolverla perfectamente.
Figura 3. Una vez disuelta la sacarosa en el medio, este se vació a una probeta
de plástico de 1l. Ya contenida la solución en la probeta, el preparado se
aforo cuidadosamente a 350ml con agua destilada. Figura 4.
La preparación
del medio se vació nuevamente al vaso depresipitados, esto para someterla al
peachimetro. Antes de realizar la determinación y regulación de pH de la
solución, el peachimetro fue calibrado por el facilitador, el cual hizo uso de
soluciones buffer con un pH de 4.0 y otra de 7.0. Ver figura 5. Una vez
calibrado el aparato se prosiguió a medir el pH de la preparación, para ello se
presionó el botón de standbay y fueron sumergidos los electrodos a la solución,
por consiguiente se desactivo el botón standbay y se determinó el pH de esta,
el cual fue muy bajo y para elevarlo entre un rango de 5.7 - 6.0 le fue
agregado HCl. Ver figura 5. Ya determinado y establecido el pH dentro del rango
establecido se retiraron los electrodos del medio y se volvió a activar el
botón standbay para que otro equipo prosiguiera con a realizar el mismo
proceso.
La
solución ya preparada y con un pH adecuado se colocó sobre la plancha eléctrica
a una temperatura de 100 ºC, ahí se dejo hasta alcanzar una
temperatura entre el rango de 50 – 70 ºC, la cual fue medida con un termómetro
de mercurio, ya alcanzado el rango establecido,la temperatura de la plancha se
bajó a 40 ºC,
posteriormente se agregó el phytagel de forma lenta y cuidadosa, mientras se
incorporaba a la solución, al ser agitado con una pipeta de vidrio
constantemente, al terminar el vaciado del phytagel se volvió a subir la
temperatura a 60 ºC y se dejó ebullir el medio, contando a
partir de su ebullición 2 min, para posteriormente retirarlo de la plancha y
dejarlo secar sobre un cuaderno en la mesa de trabajo. Figura 6.
6.4. Vaciado y guardado del medio de
cultivo
Antes
de realizar el vaciado del medio de cultivo fueron etiquetados 15 frascos de
vidrio con tapa, utilizando un 16 como referencia, al cual se le agrego 20ml de
agua y se selló, esto para hacer un vaciado uniforme del medio en los 15
frascos etiquetados.
El
vaciado del medio de cultivo se realizó cuidadosamente, utilizando una franela
para evitar quemaduras, por consiguiente fue vaciado el medio en cada uno de
los frascos y al finalizar fueron cerrados cada uno con su respectiva tapa.
Figura 7.
Una
vez llenados y cerrados herméticamente los frascos fueron sellados con plástico
para evitar su contaminación, por consiguiente se colocaron en una charola y
fueron almacenados enla hielera del refrigerador.
VII. RESULTADOS
Los
resultados obtenidos en la presente práctica fueron los esperados, ya que fue
posible conocer y realizar el procedimiento de la preparación del medio de
cultivo MS de forma exitosa.
Para
determinar la cantidad de cada una de las soluciones stock que debían integrar
el medio nutritivo a formular, se hicieron los cálculos necesarios. Estos
cálculos consistieron en formular 350 ml de medio el cual se formuló a una
concentración de 1x, para ello se multiplicaron las cantidades anteriores y
fueron divididas entre la concentración (100x) de cada una de las 6 soluciones
madre ya preparadas. Tabla 1.
Tabla 1. Cálculos realizados para vaciar
las soluciones stock al medio fueron las siguientes:
SOLUCIÓN STOCK
|
CÁLCULOS
|
Nitratos
|
350 ml*1x/100x=3.5ml
|
Sulfatos
|
350 ml*1x/100x=3.5ml
|
Quelatos
|
350 ml*1x/100x=3.5ml
|
PoBoMo
|
350 ml*1x/100x=3.5ml
|
Alógenos
|
350 ml*1x/100x=3.5ml
|
Orgánicos
|
350 ml*1x/100x=3.5ml
|
Fue
necesario realizar cálculos para adherir al medio azúcar y gelificante, para
ello se hizo una regla de tres, donde se multiplico el volumen del medio a
preparar (350ml), por 30g de sacarosa que corresponden a la solución en un
litro de medio, por ello se buscó obtener la cantidad en gramos de azúcar, de
tal forma que el resultado de la multiplicación fue dividido entre 1000ml,
obteniendo así la cantidad de azúcar a pesar. Tabla 2. Para calcular la
cantidad de phytagel que se debía adherir a la preparación, se siguió el mismo
proceso pero multiplicando el volumen del medio por 3g, los cuales corresponden
a la solución de gelificante en un litro de medio, lo obtenido de la multiplicación
fue dividido entre 1000ml, dando como resultado la cantidad de phytagel que fue
agregada al medio. Tabla 2.
Tabla 2. Cálculos realizados para el
pesado se sacarosa y phytagel.
SACAROSA
|
PHYTAGEL
|
350ml*30g/1000ml=10.5g
|
350ml*3g/1000ml=1.05g
|
Una vez realizados los cálculos, de la sacarosa y el
phytagel, estos solutos fueron pesados en la balanza analítica.
Figura 1. Calibración y pesado se
solutos: a) calibrado de la balanza analítica; b) pesado de
10.5g de sacarosa;
c) pesado de 1.05g de gelificante phytagel.
Al
iniciar la preparación del medio de cultivo se colocaron las soluciones madre
sobre la mesa de forma ordenada para extraer la cantidad calculada (3.5ml) de
cada una de ellas de forma ordenada y agregarlas a la preparación. Figura 2.
Figura 2. Vaciado de las soluciones
stock a la preparación: a) soluciones stock con su respectiva pipeta; b)
extracción de la solución stock; c) vaciado de la solución stock a la preparación.
El
azúcar se vacío a la preparación y se disolvió agitándose con una pipeta de
vidrio. Figura 3.
Figura 3. Disolución de la sacarosa a
la preparación del medio de cultivo.
Una
vez disuelta la sacarosa en la preparación, esta se vació a una probeta de
plástico donde fue aforada cuidadosa y exactamente a 350ml. Figura 4.
Figura 4. Aforado de la preparación
del medio de cultivo a 350ml.
Para
medir el pH del medio nutritivo a preparar se hizo uso del peachimetro, el cual
fue calibrado con soluciones buffer de 4 y 7 de pH. Una vez calibrado, se midió
el pH del preparado dando como resultado un pH de 4.42, el cual fue
estabilizado dentro del rango establecido (5.7-6.0), para ello le fue agregado
HCl subiendo el pH a 5.81. Figura 5.
Figura 5. Calibración del peachimetro
y medición de pH: a) calibración del peachimetro con buffer de 7; b)
peachimetro calibrado; c) medición del pH del preparado; d) adición de HCl para
elevar el pH; e); agitado de la preparación con HCl; f) preparación con pH
dentro del rango establecido.
Para
realizar la adición del phytagel a la preparación del medio de cultivo, primero
que nada se colocó la solución sobre la plancha eléctrica, a la cual se le
vació el gelificante poco a poco cuando presento una temperatura de 70 ºC. El
gelificante fue disuelto con una varilla de vidrio e incorporado a la solución,
posteriormente se dejó ebullir durante dos minutos y se dejó enfriar sobre la
mesa de trabajo. Figura 6.
Figura 6. Adición del gelificante al
medio de cultivo: a) medición de la temperatura; b) vaciado del phytagel al
medio; c) agitado del medio de cultivo para incorporar el gelificante; d) ebullición
del medio de cultivo.
El
medio de cultivo caliente fue vaciado cuidadosamente a 15 frascos de vidrio
previamente etiquetados, para ello se usó una medida de referencia en otro
frasco (20ml), esto para hacer un vaciado relativamente uniforme, una vez
vaciado el medio, los vasos se cerraron y sellaron para almacenarlos en la hielera
del refrigerador. Figura 7.
Figura 7.
Vaciado y almacenado del medio de cultivo: a) vaciado del medio de cultivo; b) cerrado
de los frascos herméticamente; c) sellado de los frascos; d) almacenado de los
medios de cultivo.
VIII.CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
8.1.
CONCLUSIONES
Con
la realización de la práctica de preparación de medios para el cultivo de
tejidos vegetales, se lograron los objetivos establecidos en la misma, proporcionando
al alumno gran conocimiento de cómo prepararlo y cuáles son los nutrimentos necesarios
de acuerdo a la consistencia que el medio de cultivo obtuvo. Es importante
mencionar que se obtuvieron buenos resultados ya que se pudo hacer la
preparación del medio sin dificultad alguna.
Una
vez realizado el medio de cultivo para vegetales será posible propagar
explantes en ellos obteniendo vegetales in vitro.
8.2.
RECOMENDACIONES
Es necesario que cuando se prepare el medio
de cultivo para tejidos vegetales se tomen las medidas necesarias para que el
preparado tenga las condiciones físicas y químicas necesarias para una buena
propagación de cultivos in vitro en un futuro.
Se recomienda que el phytagel se le agregue a
la solución cuando esta se encuentra caliente para que se pueda disolver
perfectamente y que este mismo se agregue pausadamente y en pequeñas
cantidades.
Es recomendable que cuando se realicen prácticas
o investigaciones se hagan con el cuidadonecesario ya que cuando se le agrega
el gelificante se tiene que diluir completamente para evitar que queden grumos
en la solución y así obtener una buena preparación de medio para el cultivo de
tejidos vegetales.
IX.-FUENTES
CONSULTADAS
Gonzales,
cruz, caramillo, silos. 2000. Biotecnología Vegetal. (Cultivo de tejidos,
manual) SEP, México, 133p.
Pierik
R.L. 1991. Cultivo in Vitro de plantas superiores. 1 Ed. Mundiprensa España.
Difco
y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos.
Merck.
2002. Microbiology Manual
Alimentaria.
Organización Panamericana de la Salud. Harla S.A. México D.F.
Prof.
Sofía Gutiérrez de Gamboa.
Krikorian A.D. 1990. Capítulo 3 Medios de cultivo: generalidades,
composición y preparación. Departament of Biochemestry, State University Stony Brook. New York,
E.U. 37 p.
Ortega,
Y; Quevedo F. 1991. Garantía de la Calidad de los Laboratorios de Microbiología
Pedrique de Alucio, M. 1992. Microbiología: Manual de
medio generales segunda edición. Facultad de Farmacia. Universida
