miércoles, 25 de abril de 2012

2.3.7.- TRASPLANTE AL SUSTRATO




2.3.7.- TRASPLANTE AL SUSTRATO
ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTES
Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo de las auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.
ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTES ENRAIZADOS
Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantes o plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se plantarán en contenedores (almacigueras) cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada. La elección de un sustrato con buenas características físicas, es clave para el éxito de esta etapa. Para el trasplante, elegimos un sustrato suelto, poroso, con mezcla de arena turba, cáscara de arroz quemado, para permitir un desarrollo y crecimiento de raíces muy rápido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de acuerdo a la especie con la que estamos trabajando. Luego de retirar cuidadosamente el agar de las raíces para evitar dañarlas, los plantines se enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla de sustratos seleccionada y cubiertos con nylon. Todos los días se debe controlar el nivel de humedad en las almacigueras. Si es necesario, se aplica un riego con una pulverizadora manual, para mantener un ambiente húmedo a nivel del sustrato. A los 15 días del trasplante, se puede comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de menor calor (temprano en la mañana o en la última hora de la tarde). Al comienzo las plantas se dejan media hora por día destapadas. A la semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al mes del trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de nuevas hojas, las plantas pueden permanecer destapadas. Las condiciones del cultivo in vitro, generan cambios en algunos aspectos anatómicos y fisiológicos de las plantas, por esta causa, durante la aclimatación, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estrés y tener mayor tasa de sobrevivencia.

2.3.6.- CAMBIOS FISIOLOGICOS DEL EXPLANTE


2.3.6.- CAMBIOS FISIOLÓGICOS DEL EXPLANTE

No realiza fotosíntesis.

Crecimiento en condiciones controladas.

Crecimiento en condiciones de asepsia.

Alta humedad relativa.

Estomas no funcionales ya que no cierran y por lo tanto el agua se escapa.

Ausencia de pelos radiculares tienen raices delgadas que solamente son funcionales en el frasco.

Ausencia de cera en la cutícula.

2.3.5.- CONDICIONES DE INCUBACIÓN


La incubación de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Porlo menos en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperiodo, humedad atmosférica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor), una buena y uniforme circulación de aire en el interior, dotados de un buen sistema de alarma para interrumpir la iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 ºC,  con ciclo de luz/oscuridad de 16/8 horas. La luz es generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo «luz día» con unairradiancia de entre 50 y 200µmol.m-2.s-1 .La humedad atmosférica debe ser elevada (80-90%).

Durante el período de incubación, los cultivos son expuestos a condiciones ambientales disímiles al ambiente externo. La atmósfera interna se caracteriza por presentar una considerable variación diurna en la concentración de CO2, humedad relativa elevada, temperatura constante e intensidad lumínica baja. A su vez, el medio de cultivo compuesto por concentraciones elevadas de azúcares  (en aquellos sistemas heterótrofos y semiautótrofos de micropropagación), sales y reguladores del crecimiento, sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfológicas, anatómicas y fisiológicas que las plantas deberán corregir cuando son transferidas al ambiente externo.

2.3.4.- SIEMBRA DEL EXPLANTE


La Micro propagación es el conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes cantidades. La micro propagación se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas es decir la siembra de las mismas , tales como aquellas creadas por ingeniería genética, mutagénesis o mejoramiento genético. Se utiliza también la micro propagación para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.
La expresión cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de un frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas tiene dos características fundamentales: la asepsia (ausencia de gérmenes, etc), y el control de los factores que afectan el crecimiento. El avance alcanzado por las ciencias biológicas ha permitido en los últimos años el estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular, y en condiciones de laboratorio es posible actualmente reproducir todos los factores que puedan incidir en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Este principio general se aplica también al cultivo in vitro de plantas. Haberlandt, un científico alemán, postuló a principios del siglo pasado que las plantas eran capaces de reproducir su crecimiento a partir de células aisladas, originando la hipótesis de la totipotencia celular en plantas. Sin embargo, este investigador no pudo demostrar en forma práctica su hipótesis, debido a que la mayoría de los componentes complejos que integran los medios de cultivo actuales todavía no habían sido descubiertos. Sería recién en la década del ´50 cuando se determina la importancia del balance hormonal en las plantas, con el descubrimiento de las hormonas vegetales más usadas en la actualidad.
Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el ambiente de la planta en la naturaleza es técnicamente muy complejo. Por esa razón se realiza una simplificación de la realidad escogiendo aquellos factores que se puedan mantener controlados. Cuando no se realiza el estudio con todo el ser vivo sino con solamente una parte del mismo, se utiliza el término explante para indicar la parte del órgano ó tejido vegetal que se cultiva in vitro. A la dificultad de reproducir las condiciones naturales en condiciones de laboratorio, se debe añadir en este caso la dificultad de suministrar al explante todo aquello que antes obtenía del sistema completo. En resumen, el cultivo in vitro de plantas es una técnica que exige un control específico del ambiente, tanto físico como químico, en el que se sitúa al explante. Conviene, por tanto, conocer cuales son los principales factores que conforman dicho y que deberán ser controlados.
La micro propagación o propagación clonal, es una de las aplicaciones más generalizadas del cultivo in vitro, a través de la micro propagación, a partir de un fragmento (explante) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme, con plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. El explante más usado para los procesos de propagación in vitro son las yemas vegetativas de las plantas. Los frascos que contienen las plantas se ubican en estanterías con luz artificial dentro de la cámara de crecimiento, donde se fija la temperatura en valores que oscilan entre los 21 y 23°C, además de controlar la cantidad de horas de luz. Por su parte, el medio de cultivo se compone de una mezcla de sales minerales, vitaminas reguladores de crecimiento, azúcar, agua y agar. La composición del medio depende de la especie vegetal y de la etapa del proceso de micro propagación.

2.3.3.- EXPLANTE


2.3.3.- EXPLANTE

El concepto de explante se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta, que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, raíces, pétalos, etc.), un órgano (semillas, anteras, ovarios, botones florales, hojas y raíces completas, etc.), estructuras como las anteras y los ovarios, o bien células individuales (como en el caso de los protoplastos3). Con excepción de los óvulos y el polen, los explantes están constituidos por tejidos y/o células somáticos.
El nombre “explante4” es una versión castellanizada del vocablo inglés “explante”; acuñado especialmente para identificar a los tejidos vegetales cultivados in vitro y sin otro significado. La selección del explante es un aspecto clave para tener éxito en el cultivo de tejidos, ya que dependiendo de su ubicación en la planta, del tipo de tejido que contiene, de su edad cronológica y fisiológica, de su contenido endógeno de hormonas, entre otros, se comportará de una manera o de otra.
 

2.3.2.- SELECCIÓN DE PLANTAS MADRES


2.3.2.- SELECCIÓN DE PLANTAS MADRES
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

2.3.- ESTABLECIMIENTO EL CULTIVO DE TEJIDOS


2.3.- ESTABLECIMIENTO EL CULTIVO DE TEJIDOS

2.3.1.- ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS

Etapa (0) Establecimiento de plantas donadoras de explantes

Etapa (1) Introducción asepsia (in vitro)

Atapa (2) Multiplicación

Atapa (3) Enraizamiento  

Etapa (4) Adaptación al clima

ETAPA (0) ESTABLECIMIENTO DE PLANTAS DONADORAS DE EXPLANTES

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

ETAPA (1) INTRODUCCIÓN ASEPSIA (IN VITRO)

Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces, semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de flujo laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluída durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.

ATAPA (2) MULTIPLICACIÓN

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2 originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas.

El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micro propagación permite alcanzar incrementos exponenciales,  considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.

ATAPA (3) ENRAIZAMIENTO 

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un

tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de

multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.

 ETAPA (4) ADAPTACIÓN AL CLIMA

Manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantes o plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta.

2.2.2.- FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE ESTERILIZACIÓN


2.2.2.- FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE ESTERILIZACIÓN

Existen algunos métodos de esterilización que en su utilización puede causar algunas lesiones adversas como es el caso el uso de Bicloruro de Mercurio (HgCI2); es uno de los métodos químicos más eficaces pero es muy dañino ya que en su uso causa  cáncer; se tiene que el uso del Fenol no es muy recomendable para utilizarlo como un método de esterilización debido a que este provoca ceguera al aplicador.

lunes, 23 de abril de 2012

PRACTICA N.4: SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)


SEP                      SNEST                      DGEST

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

PRACTICA N.4:
SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)

Que Presentan
Rosalina García Suárez 08930339
Yactivany Atanasio Serrano 08930340
Esbeide de Paz Leonides 08930371
Víctor Manuel Vargas Torres 08930311
Bellanira Pineda Pineda 08930130

Lic. Biología

Ciudad Altamirano, Gro. México. Marzo del 2012
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CD. ALTAMIRANO
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
PRÁCTICA No.4. SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)

RESUMEN
La presente práctica se realizó, en el laboratorio de microbiología, localizado en el Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano. Para la iniciar la siembra del material vegetal fue necesario desinfectar la cámara de flujo laminar con suficiente alcohol, así mismo los explantes utilizados de Camote de palo (Manihotesculenta) fueron desinfestados con cloralex al 5%  durante cinco minutos y dos enjuagues con agua destilada, el primero durante 1 minuto y el segundo durante 5. La siembra de los explantes se realizó en la cámara de flujo sobre el medio de cultivo MS. Los resultados obtenidos no fueron los esperados ya que más del 50% de los cultivos se contaminaron con  hongos y bacterias. Esta práctica se realizó con la finalidad de sembrar yemas axilares para la obtención de plántulas inocuas. Concluyendo  que los explantes se infestaron a causa del mal funcionamiento de la cámara de flujo laminar, aunado también a un error cometido por el docente, ya que este apagola cámara, la cualdejo de funcionar durante 15 minutos.

Palabras clave:Explantes, esterilización, desinfestar, medio MS, cámara de flujo laminar, Camote de palo (Manihot esculenta).
                                                                                     

ABSTRAC
This practice was held in the microbiology laboratory, localizado en el Instituto Tecnologico deCd.Altamirano.Tostart theplantingof plant materialwasnecessary to disinfectthelaminarflow chamberwith enough alcohol, likewise the explantsusedwoodenSweet Potato(Manihot esculenta) were disinfestedwith5%Cloralexfor fiveminutes and tworinseswith distilled water,thefirstfor 1minute and thesecond for 5. Planting ofthe explantswas performed inthe flow chamberonMS medium. The resultsobtained were notexpectedsince morethan 50% of the cultures were contaminatedwith fungiand bacteria.This practicewas performed withthe purpose ofaxillary budsgrowfor obtainingplantletsharmless.Concluding thatthe explantswere infesteddue tomalfunction of thelaminar flow hood, alsocoupledto a mistake madeby the teacher, for this I turn off thecamera, whichstopped workingfor 15minutes.


Keywords: Explants, sterilization, disinfest,MS medium,laminar flow cabinet, Camote de palo (Manihot esculenta
).                                                                        


ÍNDICE                                                                                                            PÁGINA.
I. Antecedentes……………………………………………………………………….……….5
II. Definición del problema………………………………..…………………………………6
III. objetivos……………………………………………………………………………...........7
3.1.Objetivo general……………………………………….……………………………..........7
3.2. Objetivo específico………………………………………………………………………..7
IV. Justificación…………………………………………..……………………..……..……..8
V. Fundamento teórico………………………………………………………………………9
5.1Cultivo in vitro………………………………………………………………………..……...9
5.2 Micro propagación……………………………………………….………………...………9
5.3 Tipo de explantes…………...……………………………………..…………………….....10
5.4 Asepsia de explantes……………………………………...…………..………………......10
5.5 Tapado y sellado de explantes……………………………………..…….…………….......10
V Materiales y métodos…………………………………………………………………….....12
6.1. Preparación y desinfección de la cámara de flujo laminar………..………………..........12
6.2. Introducción  y preparación del material y reactivos a utilizar dentro de la cámara de flujo laminar…………………………………………………………………….………….....................12
6.3.Desinfestación y preparación de los explantes……………………………………….........13
6.4. Siembra de los explantes al medio de cultivos……………………………………….........14
6.5. Sellado y guardado de los cultivos in vitro…………………………………………….........14
VII. Resultados………………………………………………………………………..…….........15
VII. Conclusiones  y recomendaciones………………………………..………………..........21
8.1. Conclusiones…...…………………………………………………………..…...………….....21
8.2. Recomendaciones.…………………………………………….……………………….........21
IX. Fuentes consultadas……………………………………………………….….....…….......23


 

I. ANTECEDENTES
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micro propagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fotoquímicos, estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal. El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos crecerán y se desarrollaran a partir del explante original depende de los objetivos del cultivo de tejidos, (Hicks G.S., 1980).
El cultivo de tejidos in vitro comprende, en su acepción amplia, un heterogéneo grupo de técnicas mediante las cuales un explante (parte separada de un vegetal, por ejemplo: protoplastos, célula, tejido, órgano) se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Las posibilidades de aplicación de tales cultivos se pueden resumir así: a) estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines, b) bioconversion y producción de compuestos útiles, c) incremento de la variabilidad genética, d) obtención de plantas libres de patógenos, e) propagación de plantas y f) conservación e intercambio de germoplasma, ( Roca w. M., Mroginski l. A., 1991).
Las técnicas que se emplean para cultivar protoplastos no son exactamente las mismas que se usan para cultivar meristemos; del mismo modo, un determinado sistema de cultivo puede ser de gran utilidad para el logro de un objetivo pero puede ser no útil para otro, (Bonner, J., 1936).
 

II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
En la presente práctica se pretende sembrar yemas axilares de Manihot esculenta en el medio de cultivo MS. Para ello la siembra debe llevarse a cabo en las mejores condiciones de asepsia y con materiales esterilizados, así mismo los explantes a sembrar deben encontrarse perfectamente desinfestados, esto para evitar la contaminación del medio de cultivo o infestación del explante por hongos y bacterias.
La amplitud de la definición de cultivo de tejidos y los numerosos objetivos que estos persiguen constituyen serios escollos en cualquier intento de generalización sobre los factores que afectan el establecimiento de tales cultivos in vitro, y obligan a consideraciones previas para delimitar los alcances de los mismos. Como lo son estrictas medidas de asepsia, tipo de planta y preparación aséptica de los explantes a utilizar.


III. OBJETIVOS

3.1. Objetivo general
 Realizar siembra de explantes vegetales de (Manihot esculenta)en medios de cultivo- in vitro para la propagación de plántulas.
3.2. Objetivos específicos
Preparar y desinfectar la cámara de flujo laminar
Introducción y preparado del material y reactivos a utilizar dentro de la cámara de flujo laminar
Desinfestado y preparado de los explantes
Siembra de los explantes al medio de cultivos
 Sellado y guardado de los cultivos in vitro


 
IV. JUSTIFICACIÓN
El cultivo in vitro es una técnica que permite la propagación de vegetales a partir de una pequeña porción de planta madre y por resultado se pueden obtener un gran número de plantas idénticas a la madre, libres de microorganismos y en un corto periodo de tiempo. Así mismo realizar cultivo de tejidos in vitro de plantas permitirá al alumno reconocer el manejo apropiado del material vegetal bajo condiciones estrictas de asepsia y esterilización.Ya que el cultivo in vitro, necesita condiciones óptimas para su desarrollo y crecimiento, en lo que se refiere a factores físicos y nutricionales para que no se formen colonias de bacterias y hongos. El cultivo in vitro es favorable para la multiplicación masiva de plantas a partir de un pequeño explante, lo cual favorece directamente a la economía de quien lleve a cabo este proceso.

 V. FUNDAMENTO TEÓRICO
5.1 CULTIVO IN VITRO
El cultivo in vitro se define como el cultivo en un medio nutritivo, en condiciones estériles, de plantas, semillas, órganos, explantes, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores. (Hanning, 1904)
Estas técnicas se caracterizan porque:
Ø  Ocurren a micro-escala, sobre todo en una superficie pequeña;
Ø  Se optimizan las condiciones ambientales, en lo que se refiere a factores físicos, nutricionales y hormonales;
Ø  Se excluyen todos los microorganismos (hongos, bacterias y virus), así como también las plagas de las plantas superiores (insectos y nematodos)
Generalmente no se reproduce el patrón normal de desarrollo de una planta, resultando que un tejido aislado puede dar origen a un callo o puede desarrollarse de otras formas poco usuales (por ejemplo, formación de órganos, embriogénesis somática). La capacidad de cultivar protoplastos o células individuales permite manipulaciones que antes era imposibles. El nombre de cultivo in vitro (que generalmente quiere decir en vidrio), se utilizó porque, al menos inicialmente, se usaron recipientes de vidrio para el cultivo(Hanning, 1904)
5.2 Micro propagación
La micro propagación es el conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes cantidades.Lamicro propagación se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas porla ingeniería genética, mutagénesiso mejoramiento genético.
 Se utiliza también la micropropagación para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.
5.3Tipos de explantes
Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard, 1999).
El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son más bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero sí lo es para el fito- mejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo (Fossard, 1999).
5.4 Asepsia de explantes
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte&Kleyn, 1996)
Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado.
5.5 Tapado y sellado de los explantes
 Una vez que el explante está en el medio, se sella el frasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.
Una vez que los explantes, luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento, han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte.Un porcentaje de las plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece en condiciones normales y al cabo de una semana está lista para ser trasladada al campo de cultivo (Fossard, 1999).

VI. MATERIALES Y MÉTODOS
La presente práctica fue realizada el día 13 de marzo del presente año, esta se desarrolló en el laboratorio de microbiología que se localiza dentro del instituto tecnológico de cd Altamirano.
La Cd. Altamirano municipio de Pungarabato, se localiza al noroeste del estado de Guerrero, en la región de Tierra Caliente y en las coordenadas geográficas 18°25’ de latitud norte y los 100°31’ y 100°43’ de longitud oeste. Este municipio es muy caluroso al experimentar un clima de tipo Cálido Subhúmedo con lluvias en verano y una temperatura promedio que varía de los 26 a 28 °C. Presenta una altitud de 241 msnm y una precipitación pluvial promedio de 1000 a 1,100 mm al año.
6.1. Preparación y desinfección de la cámara de flujo laminar
Para llevar a cabo la presente práctica, antes que nada fueron repartidas las laboreas a realizar, asignando por el mismo equipo, determinadas actividades a cada uno de sus integrantes, de tal forma que cada alumno se encargó de ejecutar los procesos que le correspondían.
Seinició a limpiar la superficie de trabajo en la campana de flujo laminar, para ello se hizo uso dealcohol y papel higiénico; este segundo se humedeció con abundante alcohol y sefroto sobre el área de trabajo, repitiendo una y otra vez el mismo procedimiento hasta cerciorarse de que la superficie ya se encontraba limpia. Una vez seca el área de siembra, se procedióa encender la cámara de flujo laminar para iniciar la introducción de cada uno de los artículos, materiales y reactivos a utilizar dentro de la zona de trabajo.

6.2.Introducción  y preparación del material y reactivos a utilizar dentro de la cámara de flujo laminar
El alumno responsable de trabajar en la campana de flujo laminar antes de operar en ella se esterilizo las manos con suficiente alcohol al 70%, posteriormente se introdujo en ella una lámpara de alcohol encendida y preparada anteriormente, así mismo el alumno destinado a trasportar el material estéril de afuera a una orilla de la cámara de flujo, se esterilizo las manos, mientras que el operador se encargó de organizar el material dentro del área de siembra, para ello introdujo los frascos contenedores del medio de cultivo preparados en la práctica anterior, posteriormente se introdujeron frascos estériles con agua destilada. Posteriormente se prosiguió a destapar un frasco esterilizado con  agua destilada y le fue retirada la tercera parte de esta, completando esta después con cloralex al 5%, mientras que en otro frasco vacío fueron colocadas las pinzas de metal junto con el bisturí, al cual anteriormente le fue colocada la navaja estéril. Ver figura 1.Ya listas las sustancias y material necesario para operar dentro del área de trabajo en la cámara de flujo la minar se prosiguió con la desinfección de los explantes.
6.3. Des infestación y preparación de los explantes
Posteriormente se introdujeron lasporciones de planta de guacamote o camote de palo (Manihotesculenta) a la cámara de flujo laminar y se vaciaron al frasco con la solución de cloralex al 5%, ahí se agitaron y se dejaron dúrate 5 minutos, una vez transcurrido el tiempo establecido se retiró la solución del frasco vaciándola cuidadosamente en un vaso depresipitados con capacidad de 500ml., evitando dejar salir los explantes de este. Ver figura 2. Por consiguiente los explantes fueron lavados durante 1 minuto con agua destilada, agregando esta al mismo frasco y agitándolotambién, así mismo después del minuto estimado el agua fue retirada de este de la misma forma que en el paso anterior, esto para agregar después por segunda vez agua estéril y realizar otro lavado de explantes, pero este segundo con una duración de 5 minutos, de igual forma se retiró el agua dejando solo los explantes sobre el frasco.

Una vez desinfectados los fragmentos de planta, estos se sacaron de uno por uno con las puntas de las pinzas previamente esterilizadas en alcohol y flameadas sobre la llama de la lámpara de alcohol, estas se fueron colocadas sobre una caja petri esterilizada. Por segunda ocasión se hizo uso de las pinzas metálicas, las cuales fueron esterilizadas nuevamente, para ello se sumergieron primero a al frasco con alcohol y se flamearon sobre el fuego de la lámpara de alcohol, ver figura 3., este mismo procedimiento se realizó para esterilizar el bisturí, por consiguiente se esperó a que ambos utensilios se enfriaran y se prosiguió a cortar el tejido decolorado de los extremos de cada porción de planta, así mismo fueron cortadas cuidadosamente cada uno de ellas para extraer varios explantes y evitar dañar la yema axilar, que en este caso fue el explante que se pretendió propagar. Ver figura 4. Este procedimiento fue realizado para cada una de las porciones de planta hasta completar los 15 explantes requeridos.

6.4. Siembra de los explantes al medio de cultivos
Una vez realizada la desinfección de los explantes de guacamote o camote de palo (Manihotesculenta),se prosiguió a sembrar cada uno sobre los medios de cultivo preparados en la práctica anterior, para ello se hizo uso de las pinzas, con las cuales fue tomado el explante, para ello, estas fueron esterilizadas con alcohol y sometidas a la flama de la lámpara de alcohol, prosiguiendo de tal forma a tomar con ellas el explante y abrir un frasco de cultivo para introducir este sobre el medio, así mismo una vez sembrado el explante sobre el sustrato, se volvió a cerrar el frasco. Ver figura 5. Este mismo procedimiento se realizó para sembrar los quince explantes sobre su respectivomedio nutritivo, cabe mencionar que en este equipo el maestro indicó sembrar tres explantes por integrante.Así que cada uno se responsabilizó de estos, tomando las medidas adecuadas y condiciones de esterilidad necesarias para obtener buenos resultados. Los frascos fueron identificados con la inicial del alumno que lo sembró con la finalidad de diferenciar los cultivos.
6.5. Sellado y guardado de los cultivos in vitro
Una vez sembrados los quince explantes en su respectivo medio, los frascos fueron sellados uno, por uno, dando tres vueltas con parafilm sobre el borde entre la tapa y el frasco,esto para evitar la entrada de esporas o microorganismos que pudieran contaminar el medio. Una vez sellados los frascos estos fueron tomados cuidadosamente por su parte media y colocados sobre una charola de plástico previamente esterilizada, para transportarlos al lugar donde fueron incubados.

VII. RESULTADOS
Los resultados obtenidos en la presente práctica no fueron tan satisfactorios ya que se presentó un alto índice de contaminación por hongos y bacterias en los cultivos. Los cuales se atribuyen principalmente a la falla que presenta la cámara de flujo laminar del laboratorio de microbiología, aunado también a que facilitador cometió el error de apagar la misma, y el equipo se dio cuenta de este hecho 15 minutos después, durante los cuales se realizó la disección de los explantes y siembra de estos en los primeros 4 medios de cultivo.
Cabe mencionar que los resultados citados a continuación fueron registrados el día 21 de marzo de este año obteniendo 7 cultivos contaminados de 15, de los cuales 4 estaban infestados por hongos y 3 por bacterias, aumentando la cantidad de medios de cultivo infestados por hongos a ocho para el día 22 de marzo. Figura 6. Los registros y cálculos porcentuales se encuentran registrados en las tablas 1 y 2, y representados de forma estadística en las gráficas 1y 2.



Tabla 1. Cálculos de los medios de cultivo contaminados y no contaminados.
DATOS
CALCULOS
Total de medios de cultivo sembrados: 15
15 Cultivos= 100%
Cultivos contaminados: 8
15 Cultivos                  100%
8 Cultivos                   53%
Cultivos no contaminados: 7
15 Cultivos                  100%
7 Cultivos                   47%

Grafica 1. Porcentaje de cultivos contaminados y no contaminados.







Tabla 2. Cálculos de los medios de cultivo contaminados tanto por hongos como por bacterias.
DATOS
CÁLCULOS
Total de medios de cultivo contaminados: 8
8Cultivos= 100%
Cultivos contaminados por hongos: 5
8 Cultivos                  100%
5 Cultivos                   62.5%
Cultivos contaminados por bacterias: 3
8 Cultivos                  100%
3 Cultivos                   37.5%

Grafica 2. Porcentaje de medios de cultivo contaminados por hongos y por bacterias.












Figura 1. Introduccion y preparación de reactivos dentro de la cámara de flujo laminar:
a) Introducción de los medios de cultivo a la campana de flujo laminar; b) preparación de la solución cloralex al 5%.







 Figura 2. Desinfección de las porciones de Manihot esculenta: a) desinfección de las porciones de planta en cloralex al 5%; b) vaciado de la solución desinfectante al vaso depresipitados.

 



Figura 3. Esterilización del material metálico: a) esterilización de las pinzas de disección por calor seco; b) flameado del bisturí sobre la llama de la lámpara de alcohol.


Figura 4. Disección del tejido decolorado de la porción de planta Manihot esculenta para la extracción de explantes.





Figura 5. Siembra de explantes (yemas laterales de Manihot esculenta): a) toma del explante con las pinzas de disección; b) siembra del explante sobre el medio nutritivo MS.


Figura 6. Medios de cultivo in vitro de Manihotesculenta contaminados tanto por hongos como por bacterias.


VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
8.1.Conclusiones
De acuerdo a los objetivos establecidos en la practica se pudo conocer el manejo apropiado que se les dio a los explantes que se sembraron en el medio de cultivo in vitro y cuales deben de ser las medidas de asepsia que se tiene que llevar a cabo dentro de la cámara de flujo laminar; en este caso se puede decir que la practica no fue tan satisfactoria debido a que la cámara estuvo fallando es por ello que hubo un gran porcentaje de contaminación por lo cual esto hiso que el manipuleo de los explantes a sembrar se hiciera mucho más difícil teniendo como consecuencia un 53% de contaminación de los explantes sembrados en el medio de cultivo; ya que estos fueron colonizados tanto de hongos como de bacterias siendo así esta practica fue como un ensayo para aprender como se debe de hacer el proceso de la siembra de cultivos in vitro .
8.2.Recomendaciones
ü  Se recomienda que la cámara de flujo laminar funcione perfectamente ya que de esto dependerá la seguridad de que no se contaminen la siembra de los cultivos.
ü  Se recomienda que la cámara de flujo laminar se limpie completamente para evitar que haya esporas de hongos o algún tipo de microorganismos que puedan afectar, antes de proceder con la siembra de los explantes,
ü  Es preferible que cuando se estén manipulando los explantes se haga de la mejor manera; es decir que el operador que este trabajando con ello se desinfeste bien las manos con alcohol al 70% para matar cualquier microorganismo.
ü  También es recomendable que se esterilicen bien las pinzas, el bisturí  para evitar la contaminación de los explantes durante la disección esto se debe de realizar con las medidas necesarias de saneamiento ya que de esto dependerá el obtener buenos resultados.
ü  Se recomienda que el operador que este frente a la cámara de flujo laminar tome en cuenta las medida sanitarias que debe de tener para evitar que los explantes se contaminen para ello la persona que esta haciendo todo el proceso no debe de meter la cabeza a la cámara de flujo laminar también debe de evitar el estar hablando, y algo muy importante siempre que se este realizando la siembra esto se debe de hacer en medio de la cámara así para evitar que los medios de cultivos in vitro se contaminen tanto de hongos como bacterias.

IX. FUENTES CONSULTADAS
Favian.Rojas.@hotmil.com.mx (Kyte & Kleyn 1996 http://cultivo de vegetales. blogspot. Mx /2010/09/ explantes. html).
Asucenaortiz.bio@hotmail.com.mx1999,http://cultivodevegetales.blogspot.mxfe. Consultado 2010/09/ explantes. html).
Bonner, J. 1936. Plant tissue cultures from a hormone point of view. Proc. Nat. Acad. Sci. 22: 426-430.
Carmen.360@gmail.com.mx                                                                      (Fossard 1999, http://cultivodevegetales.blogspot.mx/2010/09/explantes.html).
Franciscojv@gmail.com.mx
González, Cruz, Camarillo, Silos. 2000, Biotecnología Vegetal  (cultivo de tejidos, manual); SEP. 133p.
Hicks G.S. 1980. Patterns of organ development in plant tissue culture and the problem of organ determination. Bot. Rev. 46: 1-23.
Javier.90@hotmail.com.mx(Fossard.1999,http://cultivodevegetales.blogspot.mx/2010/09/explantes.html).
Jose.02@hotmail.com.mx(dictionary.reference.com. 2008.http://es.wikipedia.org/wiki/Micropropagacion; Consultado el 17-03-
Mariavasquez.08@hotmail.com.mx http://cultivodevegetales. blogspot. Mx /2010/09/ explantes. html).
Pedro.rsy@hotmail.com.mx http://cultivo de vegetales. blogspot. Mx consultado /2010/09/ explantes. html).
Pellón. 1986. La Ingeniería Genética y sus Aplicaciones. Acribia. México. 237
Ricardo.frag@hotmail.com.mx 1998 http://www.jardinbotanicodecordoba.com/inves_cons_cult_invi.php
   ROCA W. M., MROGINSKI L. A. 1991, Cultivo de tejidos en la agricultura:      fundamentos y      aplicaciones. Ed. Centro Internacional de Agricultura Tropical, Colombia.