PRÁCTICA 2: “PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRE”

                       

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE

CD. ALTAMIRANO

PRÁCTICA 2:

“PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRE”

   M.C. Francisco Javier Puche Acosta

PRESENTAN:

Rosalina García Suárez 08930339

Yactivany Atanasio Serrano 08930340

Esbeide de Paz Leonides 08930371

Víctor Manuel Vargas torres 08930311

Bellanira Pineda Pineda 08930130

 LIC. BIOLOGÍA

 CD. ALTAMIRANO, GRO.              FEBRERO 2012

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CD. ALTAMIRANO

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

BIOTECNOLOGÍA APLICADA

PRÁCTICA No.2.

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRE

RESUMEN

La presente práctica se realizó, en el laboratorio de microbiología, localizado en el Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano. Se preparó una solución madre de nitratos, de la cual se pesaron 33g de nitrato de amonio y 26g de nitrato de potasio en la balanza analítica, para aforarse a 200ml con agua destilada. El resultado obtenidofue una solución madre con un volumen de 200ml, la cual se almaceno en una botella ámbar, para ser utilizada posteriormente en el medio nutritivo. El Cálculo y pesado de sales, para la preparación de la solución stock de nitratos fue el objetivo perseguido en el presente trabajo, con esto se llegó a la conclusión que, para preparar una solución madre se tiene que medir con exactitud, la cantidad de reactivo requerida en cada preparación, esto con la finalidad de que no existan variaciones que perjudiquen el desarrollo del tejido vegetal a propagar.

Palabras clave:solución madre, nitrato de amonio, nitrato de potasio, medio de cultivo.

ABSTRACT

This practice was held in the microbiology laboratory, located in the Technological Institute of AltamiranoCity. Was prepared a solution of nitrates, which weighed 33g of ammonium nitrate and potassium nitrate 26g on ​​the analytical balance, to gauging to 200ml with distilled water. The result obtained was a solution with a volume of 200ml, which were stored in an amber bottle for later use in the nutrient medium. The Calculation and heavy salts for the preparation of the nitrate stock solution was the objective pursued in this work, it is concluded that, to prepare a stock solution must be measured accurately, the amount of reagent required in each preparation, this in order that there are no variations that may impair the development of plant tissue to propagate.

Keywords: stock solution, ammonium nitrate, potassium nitrate, the culture medium.

ÍNDICE

PÁGINA.

1.Antecedentes………………………………………………………………………......5

2.Definicióndel problema…………………………………................................................6

3. Objetivos………………………………………………………......................................7

3.1.Objetivo general…………………………………………..............................................7

3.1.Objetivoespecífico……………………………………………………………………..7

4. Justificación……………………………………………………………………….........8

5. Fundamento teórico…………………………………………………………………...9

5.1 Solución Madre o Stock………………………………………………………………..9

5.2 Macronutrientes………………………………………………………………………….9

5.3 Micronutrientes………………………………………………………………………….10

5.4 Preparación de medios de cultivo…………………………………………………….10

5.4.1 Preparación de una solución stock de macronutrientes MS x10 (solución 1)…...10

5.4.2 Preparación de una solución stock de micronutrientes MS x 100 (solución 2).....11

6. Materiales y Métodos…………………………………………………………………..12

6.1. Forma de trabajo y cálculos para realizar la solución stock………………………...12

6.2. Pesado de nitrato de amonio y nitrato de potasio…………………………………...12

6.3. Aforar y preparar la solución stock de los nitratos…………………………………...13

7. Resultados……………………………………………………………………….….......14

8. Conclusiones……………………………………………………………………………18

9. Recomendaciones….…………………………………………………………………..19

10. Fuentes consultadas………………………………………………………..………..20

I.ANTECEDENTES

Los medios generalmente son preparados a partir de soluciones Stock previamente mezcladas. Las alícuotas de estas soluciones son medidas y agregadas aun volumen dado de agua. En algunos casos los componentes indicados son pesados y agregados directamente al volumen de agua, quedando así preparado el medio. Los procedimientos incorrectos pueden causar precipitaciones, especialmente nitratos y fosfatos. Las soluciones Stock pueden prepararse y almacenarse en frio por largo tiempo, por lo cual se recomienda el uso de recipientes con tapa de vidrio. Todas estas soluciones deben prepararse con agua destilada, (Stein R. Janet, 1994).

Cuando una solución es de uso corriente en un laboratorio, se suele preparar una solución madre (solución Stock) de la misma y, a partir de esta, realizar la dilución que se necesite (llamada solución de trabajo) en el momento de usarla. Esto puede disminuir el volumen de almacenamiento de las soluciones y, además, muchas veces las soluciones concentradas son más estables que las diluidas. Un límite importante a tener en cuenta en la preparación de soluciones concentradas es la solubilidad de cada soluto (que tendrá una solubilidad determinada en una temperatura dada).

Se dice que una solución Stock es Nx (N por) cuando está concentrada N veces respecto de la de uso corriente. La solución de trabajo seria 1x. Esta forma de nomenclatura es particularmente útil para soluciones de varios solutos e indica que todos estos solutos estarán N veces más concentrados que lo que se esperaría en la solución de trabajo, (Guía de Trabajos Prácticos – Introducción a la Biología Molecular y Celular, 2011).

En un cultivo in vitro de tejidos vegetales, se denomina solución madre o Stock a cualquier solución de composición elevada y concentración definida, en la que el soluto puede ser uno o más compuestos químicos de los que conforman un determinado medio de cultivo y que mediante un proceso de dilución permita la preparación de 1 litro de medio de cultivo, (Pierik, 1990).

II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

Para cultivar tejidos vegetales es necesario proveer un medio nutritivo idóneo para que la planta se desarrolle, es por ello ineludible preparar soluciones madre, estándar o stock, ya que estas constituyen y juegan un papel de gran importancia en él. Para prepararlasprimero hay que reconocer el reactivo del cual será preparada la solución y asegurar que es el correcto, así mismo se necesita realizar cálculos precisos y exactos. Al pesar los reactivos se requiere de gran exactitud para asegurar buenos resultados, las soluciones a preparar deberán estar definidas adecuadamente y aforadas de acuerdo a las indicaciones que el docente establezca para un volumen determinado.

III. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

Calculo y pesado de sales, para la preparación de la solución stock de nitratos.

3.2. OBJETIVO ESPECíFICO

 Forma de trabajo y cálculos para realizar la solución stock

 Pesado de nitrato de amonio y nitrato de potasio

 Aforar y preparar la solución stock de los nitratos

IV. JUSTIFICACIÓN

Realizar soluciones stock o bien soluciones madre, es una alternativa para preparar medios de cultivo en concentraciones definidas de nutrientes, de tal forma que el medio sea apto para una determinada especie vegetal y para su optimo crecimiento y desarrollo como cultivo in vitro. Una vez que el alumno se enfrente a la preparación de soluciones madre de un determinado reactivo, aprenderá a identificarlo, así como también a realizar cálculos para su pesado y disolución, lo cual fortalecerá su conocimiento y  experiencia para preparar soluciones stock en posteriores practicas o situaciones.

V. FUNDAMENTO TEÓRICO

5.1.Solución Madre o Stock

Una soluciónes una mezcla homogénea cuyas partículas son menores a 10 angstrom. Estas soluciones están conformadas por soluto y por solvente. El soluto es el que está en menor proporción y por el contrario el solvente esta en mayor proporción. Para diluir una solución es preciso agregar más % de disolvente a dicha solución y éste procedimiento nos da por resultado la dilución de la solución, y por lo tanto el volumen y concentración cambian, aunque el soluto no. Una solución madre o stock es una concentración de algún macro o micro nutriente necesario para el desarrollo adecuado  de explantes vegetales.

5.2. Macronutrientes

Son los que se requieren en cantidades de milimoles y son los elementos requeridos en mayor cantidad, (carbono C), oxígeno (O) e hidrógeno (N), aminoácidos, Vitaminas, proteínas y ácidos nucleicos. Comúnmente se adicionan como nitrato o amonio y menos usual como nitrito. El nitrito se añade en concentraciones de 25-40 milimoles y el amonio de 2 a 20 milimoles (Gamborg y Jerry, 1981) fósforo (P) empleado casi universalmente en forma de fosfatos; sin embargo, la alta concentración de fosfato en solución puede detener el crecimiento, azufre (S) como sulfato y con la posibilidad que se agregue en forma de sulfito o como sulfuro, pero con menos efectividad (Nitsch y Nitsch, 1969). Como fuente de azufre, además de los sulfatos, sulfitos, se encuentran la cisteína, metionina o glutation. La deficiencia de azufre da por resultado una etiolación; magnesio (Mg) es componente fundamental de la molécula de clorofila; el calcio (Ca) es parte importante integral de la membrana celular, además confiere protección a la membrana contra los efectos deletéreos de los metales pesados, salinidad y pH muy bajos; usualmente se adiciona como cloruro de calcio (CaCl2 2H2O)m nitrato de calcio (Ca (NO3)2) y menos comúnmente como fosfato tricálcico (Ca 3  PO4); fósforo y el potasio como el catión mayor y se adiciona en la forma de KNO3, KI, KCI Y K2 PO4. En términos general fósforo, calcio, magnesio y azufre son requeridos en concentraciones de 1 a 3 milimoles para un buen crecimiento. Sin embargo, existe un antagonismo entre el Ca² y el Mg². Cuando la concentración de Mg²+ es alta, se requiere también alta Ca²+. La concentración comparativa es a menudo más importante que la concentración absoluta de iones.

5.3. Micronutrientes

Los micronutrientes o elementos menores se añaden en concentración micromolar. Los elementos menores son seis, a saber: Fierro (Fe), zinc (Zn), manganeso (Mn), cobre (Cu), cobalto (Co), boro (B) y molibdeno (Mo) que forman parte de la estructura de algunas proteínas vegetales, o vitaminas de interés bioquímico-fisiológico. De los 6 elementos, el Zn, Mn, Fe, Cu y Mo intervienen en la síntesis de la clorofila y en la estructura del cloroplasto (Sundqvist et al, 1980). El manganeso es considerado como uno de los más esenciales, junto con el boro y el fierro; además tiene importancia de la fotosíntesis en donde interviene en la conservación de la ultraestructura de los cloroplastos. De acuerdo a Galston y Hillman (1961), el Mn es un cofactor de las enzimas peroxidasa que permiten la oxidación del ácido indolacético en las células vegetales. Doershug y Miller (1967) mencionan que la omisión reduce el número de brotes en cotiledones de lechuga. Asimismo su adición en alta concentración puede compensar la carencia del Mo en raíz de jitomate (Hannay y Street, 1954). En ocasiones el manganeso puede remplazar al magnesio, en algunos sistemas enzimáticos (Hewitt, 1948).

5.4.Preparación de medios de cultivo

5.4.1.Preparación de una solución stock de macronutrientes MS x10 (solución 1)

Para obtener un litro de dicha solución llénese un Erlenmeyer de 1 l con 500 ml de agua destilada. A continuación añádase cada uno de sus componentes (Tabla 1) disolviéndolo totalmente antes de añadir el siguiente:

Substancia	Peso (en gramos)
NH4NO3	16,5
KNO3	19,0
CaCl2·2H2O	4,4
MgSO4·7H2O	3,7
KH2PO4	1,7

Para finalizar, bastará con verter el contenido en una probeta de 1 l, enrasar con agua destilada, trasladar la solución a su recipiente definitivo y agitarlo.Esta solución debe guardarse a 4 ºC.

5.4.2. Preparación de una solución stock de micronutrientes MS x 100 (solución 2)

Para obtener un litro de dicha solución llenar un Erlenmeyer de 1 l con 500 ml de agua destilada. A continuación añadir cada uno de sus componentes (Tabla 2) disolviéndolo totalmente antes de añadir el siguiente.Para terminar, proceder del mismo modo que con la solución stock de macronutrientes. Esta solución también debe almacenarse a 4 ºC.

Substancia	Peso (en mg)
MnSO4·4H2O	2.230,0
ZnSO4·7H2O	860,0
H3BO3	620,0
KI	83,0
Na2MoO4·2H2O	25,0
CuSO4·5H2O	2,5
CoCl2·6H2O	2,5

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

La presente práctica se desarrolló en el laboratorio de microbiología que se localiza dentro del instituto tecnológico de cd Altamirano.

La Cd. de Altamirano municipio de Pungarabato, se localiza al noroeste del estado de Guerrero, en la región de Tierra Caliente y en las coordenadas geográficas 18°25’ de latitud norte y los 100°31’ y 100°43’ de longitud oeste. Este municipio es muy caluroso al experimentar un clima de tipo Cálido Subhúmedo con lluvias en verano y una temperatura promedio que varía de los 26 a 28 °C. Presenta una altitud de 241 msnm y una precipitación pluvial promedio de 1000 a 1,100 mm al año.

6.1. Forma de trabajo y cálculos para realizar la solución stock

Para llevar a cabo la practica el día 20 de febrero del presente año, el facilitador organizo a los alumnos por equipos de cinco integrantes cada uno, así mismo prosiguió a repartir los grupos de sales y compuestos orgánicos a cada equipo con la finalidad de que todos trabajaran. A este equipo le fue asignado el grupo de los nitratos, el cual comprende dos sales, que son: nitrato de amonio y nitrato de potasio. Posteriormente se realizaron los cálculos para realizar la solución stock con estas.

Los cálculos que se hicieron fueron para ambas sales (nitrato de amonio y nitrato de potasio). Se realizó a una concentración de 100x y a un volumen de 200ml. Tabla 1.

6.2. Pesado de nitrato de amonio y nitrato de potasio

Para iniciar la preparación del medio de cultivo primero fueron identificadas las sales nitrato de potasio y nitrato de amonio en el área de reactivos del laboratorio de microbiología, una vez localizados ambos reactivos se  calibro la balanza analítica (ver la figura 1) para realizar un pesado preciso de estos, así mismo otro compañero se encargó de elaborar dos pequeñas charolas de papel aluminio, sobre las cuales fueron colocadas las dos sales en la balanza.

El alumno encargado de realizar el pesado de los nitratos lo hizo cuidadosamente cuidando ser lo más exacto posible, así mismo empleo los cálculos realizados anteriormente. La primer sal en pesar fue el nitrato de amonio, de la cual se pesaron 33g., posteriormente fue puesta en ceros nuevamente la balanza, se introdujo la segunda charola de aluminio bacía y se pesaron 26g. de nitrato de potasio. Figura 1.

6.3. Aforar y preparar la solución stock de los nitratos

Una vez pesadas las dos sales del grupo de los nitratos se procedió a medir en una probeta 50mL de agua destilada, por consiguiente se vacío el nitrato de amonio a un vaso depresipitados con capacidad de 500mL. Por consiguiente se agregó agua a la charola para escurrir en el vaso los residuos de la sal que se adhirieron al papel, después se agregaron los 50mL de agua destilada medidos en la probeta. Posteriormente se agito el contenido del vaso con una pipeta de vidrio; ya disuelta el primer sal se agregó la segunda, el nitrato de potasio, realizando el mismo procedimiento q para la primera, ambas se disolvieron siendo agitadas con la probeta. Figura 2.

Para incorporar completamente ambas sales se colocó la solución sobre la plancha eléctrica a una temperatura de 30 °C, durante 5 minutos, agitándola cuidadosamente con la misma pipeta de vidrio ver la figura 3.

Ya incorporadas ambas sales fueron vaciadas a una probeta para aforar ahí la solución a 200 mL con agua destilada, esto se realizó cuidadosamente para obtener un volumen exacto de la solución stock de nitratos ver la figura4 en el apartado de  resultados.

VII. RESULTADOS

Los resultados obtenidos en la presente práctica fueron los esperados, ya que los cálculos realizados fueron los correctos y se logró calibrar la balanza analítica de forma correcta, en la cual se pesaron los nitratos, estos a su vez también fueron disueltos con éxito y de forma rápida en el agua destilada, gracias a que se calentó la solución en la plancha eléctrica, del tal forma que el nitrato de potasio se integró completamente con el nitrato de amonio formando una mezcla homogénea.

Saber realizar y preparar soluciones madre de forma correcta, es de gran importancia, puesto que contribuye a asegurar en cierta forma obtener buenos resultados al momento de cultivar vegetales in vitro.

Los cálculos de las sales es la primera herramienta que el alumno debe desarrollar para saber preparar soluciones stock. Los cálculos realizados en la presente práctica se citan a continuación:

Nitrato de amonio: NH4NO3	Nitrato de potasio: KNO3
NH4NO3= 1.650g/l	KNO3= 1.300g/l
1.650*100x=165g/l	1.300*100x=130g/l
165g/l*200ml/1000ml= 33g	130g/l*200ml/1000ml= 26g

Tabla 1. Cálculos realizados para las sales nitrato de sodio y nitrato de potasio.

El procedimiento fue realizado con calma y sin presiones, ya que los procesos a desarrollar requerían de paciencia y concentración para poder ser ejecutados. Los resultados y procesos abordados se ilustran y citan en la siguiente página.

Figura 1. Pesado de las sales en la balanza analítica: a) calibración de la balanza analítica; b)pesado del nitrato de amonio; c) pesado del nitrato de potasio.

Figura 2. Preparación de la solución stock: a) sales de nitratos pesadas; b) vaciado de la primer sal NH₄NO₃; c) vaciado de los residuos del primer nitrato; d) vaciado de 50Ml de agua destilada; e) agitado de la primera sal en agua destilada; f) vaciado de la segunda sal NH₄NO₃.

                               Figura 3. Calentado, agitado e incorporación de los nitratos.

Figura 4. Etiquetado y guardado de la solución: a) aforado de la solución stock a 200 mL; b) etiquetado de la solución stock en la botella ámbar; c)guardado de la solución stock sobre el refrigerador.

VIII. CONCLUSIÓNES

En la presente práctica fue posible calcular las cantidades precisas tanto de nitrato de sodio como de nitrato de potasio, así mismo ya conocida la cantidad en gramos se realizó el pesado exacto de estas y se logró preparar la solución stock de nitratos. Cabe mencionar que realizar una solución madre implica certeza y precisión, esto para asegurar buenos resultados en un futuro cuando se prepare el medio nutritivo con estas soluciones. Es de gran importancia saber realizar los cálculos e identificar los reactivos para no cometer errores de preparación. En fin es imprescindible resaltar que gracias a esta práctica el alumno adquirió nuevos y útiles conocimientos.  

IX. RECOMENDACIONES

      Para la preparación de soluciones madre es recomendable hacer bien los cálculos de los reactivos que se pesaran, esto para evitar errores.

      Es recomendable que cuando se haga la preparación de soluciones, al momento de que se estén pesando las sales no se tarde mucho tiempo debido a que estas con el aire se humedecen y esto aria más difícil el control de la balanza analítica, porque con la humedad estas pesarían más y por lo tanto no se obtendría la cantidad correcta lo cual perjudicaría en la preparación del medio de cultivo.

      Es importante que la persona que esté pesando las sales tenga mucho cuidado de que sea la cantidad correcta al pesar y no pasarse, así  como tampoco que le falte, debe ser exactamente la cantidad.

      Se recomienda que cuando se disuelvan las sales en agua destilada, esta solución se ponga sobre la plancha eléctrica a 30°C para diluirlas fácilmente.

  X. FUENTES CONSULTADAS

& Bloomfield Molly M. Química de los Organismos Vivos. México. D.F. Ed. Limusa 1997, pp. 87 – 97.

& Choppin Gregory R. Química, México Ed. Publicaciones Cultural, 1985, pp. 156, 247-349, 19-20.

& González, Cruz, Camarillo, Silos. Biotecnología Vegetal  (cultivo de tejidos, manual)  2000. SEP. 133p.

& Hill - Kolb, Química para el Nuevo Milenio. México Ed. Prentice Hall, 1998, pp. 132-133.

& joesfa@yahoo.comhttp://biotecesavf.blogspot.com/2010/01/los-medios-de-cultivo.html 25 de febrero del 2012.

&  Mary@yahoo.comhttp://blogs.mdp.utn.edu.ar/mpersico/files/2010/04/Manual-medios-cultivo.pdf. 24 de febrero del 2012.

& pablo@elkothec.Comhttp://www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/ibmc/practicos/GUIA-TP-IBMC-2011.pdf. 24 de febrero del 2012

& Pellón. Acribia. La Ingeniería Genética y sus Aplicaciones. 1986. México. 237 p.

& Pierik R.L. 1991. Cultivo in Vitro de plantas superiores. 1991.1 Ed. Mundiprensa España.