2. 1. 3. GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

2. 1. 3. GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

COMPONENTES DE UN MEDIO DE CULTIVO

•  Sales inorgánicas
•   Fuente de carbohidratos
•  Reguladores de crecimiento
•  Vitaminas
•  Aminoácidos
• Complejos orgánicos
•  Reguladores de crecimiento vegetales
•  Antioxidantes
• Material de soporte
•  Agua

NUTRIMENTOS INORGANICOS

Los minerales son muy importantes en la vida de la planta; para un crecimiento sano y vigoroso se requiere de la presencia de compuestos inorgánicos que se agrupan en macro y micronutrientes.

Macronutrimentos

Son los que se requieren en cantidades de milimoles y son los elementos requeridos en mayor cantidad, (carbono C), oxígeno (O) e hidrógeno (N), aminoácidos, Vitaminas, proteínas y ácidos nucleicos.

Comúnmente se adicionan como nitrato o amonio y menos usual como nitrito. El nitrito se añade en concentraciones de 25-40 milimoles y el amonio de 2 a 20 milimoles (Gamborg y Jerry, 1981) fósforo (P) empleado casi universalmente en forma de fosfatos; sin embargo, la alta concentración de fosfato en solución puede detener el crecimiento, azufre (S) como sulfato y con la posibilidad que se agregue en forma de sulfito o como sulfuro, pero con menos efectividad (Nitsch y Nitsch, 1969). Como fuente de azufre, además de los sulfatos, sulfitos, se encuentran la cisteína, metionina o glutation. La deficiencia de azufre da por resultado una etiolación; magnesio (Mg) es componente fundamental de la molécula de clorofila; el calcio (Ca) es parte importante integral de la membrana celular, además confiere protección a la membrana contra los efectos deletéreos de los metales pesados, salinidad y pH muy bajos; usualmente se adiciona como cloruro de calcio (CaCl2 2H2O)m nitrato de calcio (Ca (NO3)2) y menos comúnmente como fosfato tricálcico ( Ca 3  PO4); fósforo y el potasio como el catión mayor y se adiciona en la forma de KNO3, KI, KCI Y K2 PO4. En términos general fósforo, calcio, magnesio y azufre son requeridos en concentraciones de 1 a 3 milimoles para un buen crecimiento. Sin embargo, existe un antagonismo entre el Ca² y el Mg². Cuando la concentración de Mg²+ es alta, se requiere también alta Ca²+.

Micronutrientes

Los micronutrientes o elementos menores se añaden en concentración micromolar. Los elementos menores son seis, a saber: Fierro (Fe), zinc (Zn), manganeso (Mn), cobre (Cu), cobalto (Co), boro (B) y molibdeno (Mo) que forman parte de la estructura de algunas proteínas vegetales, o vitaminas de interés bioquímico-fisiológico. De los 6 elementos, el Zn, Mn, Fe, Cu y Mo intervienen en la síntesis de la clorofila y en la estructura del cloroplasto (Sundqvist et al, 1980). El manganeso es considerado como uno de los más esenciales, junto con el boro y el fierro; además tiene importancia de la fotosíntesis en donde interviene en la conservación de la ultraestructura de los cloroplastos. De acuerdo a Galston y Hillman (1961), el Mn es un cofactor de las enzimas peroxidasa que permiten la oxidación del ácido indolacético en las células vegetales.   

COMPLEMENTOS ORGÁNICOS

Se consideran complementos microorgánicos a los compuestos orgánicos que se han llamado así por que el crecimiento y en general la morfogénesis se ven mejorado.

Los complementos microorgánicos se agrupan en:

Vitaminas

Las vitaminas son consideradas como factores alimenticios secundarios requeridos por los animales en pequeñas cantidades. Sin embargo, estas sustancias, que normalmente sintetizan las plantas, son también empleadas por ellas para su crecimiento y diferenciación con papeles catalíticos en el metabolismo. Cuando las células de plantas superiores son cultivadas in vitro, las vitaminas son necesarias para el crecimiento llegando a ser su ausencia o nivel de concentración, un factor limitante. No obstante, estas necesidades dependerán de la especie. Las vitaminas que son adicionadas más usualmente como parte del medio sintético son: tiamina-HCl, ácido nicotítico, piridoxina-HCl, biotina, ácido fólico, ácido pantoténico, riboflavina.

Tiamina (B1)

La Tiamina  es esencia para el crecimiento. Es fotoestable, pero durante la esterilización por autoclave se descompone en pirimidina y tiazol; sin embargo, la mayoría de los tejidos son capaces de sintetizar tiamina a partir de los productos de su descomposición. En la naturaleza, especialmente los cereales aparecen libres y en concentraciones relativamente elevada.

Piridoxina (B6)

Es termo y fotoestable. Se localiza en semillas de cereales y no se considera esencial para la mayoría de las plantas in vitro.

Quizá el papel más importante en su participación, bien conocida, en la síntesis de purinas y pirimidinas y por lo tanto en el metabolismo de los ácidos nucleicos.

 Acido nicotínico

También se le llama niacina. Es foto y termoestable. Su principal función es ser coenzima  de las enzimas que se conoce como deshidrogenasas que catalizan las reacciones de oxido-reducción (NAD, NADP Y NADH o NADPH).

Riboflavina

Es termoestable, pero fácilmente se descompone a la luz. A bajas concentraciones (90.01 mg.l^-l) promueve el crecimiento en callos habituados de zanahoria, pero sin efecto en la oscuridad. Concentraciones de 10-50mg.l^-1  inhiben completamente el crecimiento en la luz y promueve el crecimiento en la oscuridad. La riboflavina aparece en la naturaleza como un constituyente de las flavinas coenzimas: flavin mononucleotido (FMN) y flavin adenina dinucleótida (FDA). La riboflavina es termoestable por lo que no se descompone fácilmente.

Acido pantotécnico

Es termoestable, por lo tanto, puede ser esterilizado en autoclave junto con el medio nutricional Estimula el crecimiento de levaduras, en sauce llorón. Se encuentra en la naturaleza como componente de la coenzima A. Sin embargo, no es una vitamina esencial.

Biotina

No es esencial y probablemente promueve el crecimiento del cambio en inóculo de sauce llorón. La biotina sirve como factor de crecimiento de las levaduras y algunas bacterias. Unida a su enzima específica, se relaciona íntimamente con reacciones de carboxilización.

Acido fólico

No es esencial y se descompone con el calor en soluciones ácidas. En la oscuridad inhibe el crecimiento de los tejidos, mientras que en la luz lo promueve. Reinert y White (1956) mostraron que el ácido fólico inhibe el crecimiento de tejidos de pino. Se considera como vitamina en función de coenzima.

AMINOÁCIDOS

Los aminoácidos representan, para las células, una fuente efectiva e inmediata de nitrógeno, puesto que se pueden incorporar al metabolismo mucho más rápido que el nitrógeno inorgánico, aún cuando ambas fuentes se encuentran en el mismo medio (Thom et al., 1981), sin embargo, su incorporación al medio de cultivo es bastante discutido. Es conocido que su empleo esta en función del balance adecuado de la relación NH4/NO3 que es usualmente suministrado como NO3-, NH4, NO3, NH4Cl, etc. Generalmente la inclusión de estos compuestos nitrogenados orgánicos es necesaria solamente cuando se inicia la formación de callo, se consideran como estimulantes o requeridos  durante la proliferación celular.

Los aminoácidos son usados como constituyentes de compuestos de composición química indefinida o bien por adición directa. De esta manera, se encuentran en caseína hidrolizada, peptona, triptona, lactoalbúmina hidrolizada, extracto de malta, agua de coco, casamina, etc. Los aminoácidos que se emplean directa y más comúnmente son L-glicina, L-glutamina, L-asparagina, L-arginina, L-prolina, ácido glutámico. L-hidroxiprolina, L-alanina, L-lisina, L-leucina, L-serina y L-cisteina. Nitsch y Nitsch (1957) señalan que las formas L de los aminoácidos son más adecuadas para el cultivo de tejidos que las formas -D ya que estas son tóxicas. Además, las formas racémicas son mejores para el desarrollo de tejidos que las formas puras -L de aminoácidos. Se han señalado efectos diferentes al usar isómeros de aminoácidos, por ejemplo: -L alanina es más fácilmente asimilado que la B-alanina. El ácido α aminobutírico no puede ser utilizado como fuente  de nitrógeno, pero puede remplazar completamente a los nitratos.

CARBOHIDRATOS

La sacarosa y la glucosa se utilizan en el cultivo de tejidos de muchas especies. La fructuosa, maltosa, celabiosa, rafinosa y otras, se les usa como fuente de carbono para algunas variedades de tejidos. Para la mayoría de los tejidos en cultivo es sacarosa la mejor fuente de carbohidratos (2-5%), de manera que el máximo aumento en peso fresco en los tejidos cultivados del endospermo del sorgo se obtiene con 2% de sacarosa, y el máximo de peso seco a 8%. Varios informes señalan que la sacarosa se hidroliza activamene a fructuosa y glucosa por la invertasa de la pared celular. Así por ejemplo, la sacarosa, callosidades de zanahoria, desaparece del medio de cultivo en dos días. La dextrina, pectina y almidón son aprovechados por las callosidades de Sequia y el almidón soluble es aprovechado por callosidades del endospermo del maíz o de Juniperus. Las carbohidrasas hidrolizan el almidón, maltosa o rafinosa en monosacáridos.

La combinación de algunos carbohidratos no son útiles para el crecimiento de tejidos vegetales como fuente única de carbono. Los ácidos orgánicos más efectivos, como el ácido succínico, ácido cítrico y ácido fumárico, desarrollan sólo de un 25 a 50% del crecimiento comparado con un tejido cultivado en el cual la fuente de carbono es la sacarosa Bouriquet (1958) sugiere que los ácidos orgánicos actúan sinergéticamente a bajas concentraciones del 2,4-D.

REGULADORES DEL CRECIMIENTO

Los reguladores de crecimiento se dividen en auxinas, citocininas, giberelinas y retardantes e inhibidores del crecimiento y son naturales y sintéticas.

Auxinas naturales

De acuerdo con su naturaleza, el ácido indolacético (AIA) es la única auxina natural que se localiza en las zonas de crecimiento. Tiene la peculiaridad de ser descompuesto por la luz, por lo que no es conveniente utilizarlo en cultivo en suspensión. Por ser hormona natural, su desaparición del tejido es muy rápido ya que en las plantas se encuentran las enzimas oxidasas de la que hidrolizan a la hormona de manera que su efecto es suave y de poca duración.

Auxinas sintéticas

Son auxinas sintéticas del ácido naftalenacético (ANA), ácido 2,4 diclorofenoxiacético y ácido indolbutírico (AIB). La primera y la tercera hormona forman parte de los productos que se utilizan como enrizadores.

Los tejidos aislados de plantas y las callosidades en subcultivos, requieren de auxinas. Los que no las requieren son los callos habituados y los tejidos tumorales. Para el cultivo de callosidades se usan de 0.1 a 5.0 mg/l de AIA y para la diferenciación de órganos se ha señalado a menudo que es necesario reducir la concentración de la auxina. El AIA o el ANA son mejores que el 2,4-D para la inducción de la organización celular. Si se usa 2,4-D en muchas especies de plantas tendrán la tendencia a la formación de callos, por lo que si se desea inducir la formación de órganos, se necesita cambiar el 2,4-D por otra auxina como el AIA o bien bajar la concentración.

Citocininas

Citocininas naturales son:

Zetina que se extrae del endospermo del maíz y 6 isopentenil adenina (2iP) que se aisla de Clostridium Tumerfaciens que produce un sobre crecimiento de los tejidos. Algunos tipos de tejidos requieren esencialmente citocininas, principalmente en el fenómeno de la organogénesis; por ejemplo, los callos de soya o de la médula de tabaco (var Wisconsin #38). Sin embargo, no todos los tejidos requieren citocininas, aunque algunas crecen bien en su presencia, éstas no son esenciales.

Citocininas sintéticas son:

6-benciladenina (6 BA) o también conocida como bencilanimopurina (6 BAP); la cinetina (K) también conocida como 6-furfiril amino purina (FAP). La 6-benciladenina se utiliza en concentraciones de 1.01-1.0 mg/l. También se emplea la zeatina o isopentil adenina como sustancias de naturaleza citocinética.

Acido giberélico

El ácido giberélico no se usa comúnmente para el cultivo de callo. En ocasiones se adiciona al medio para inducir alargamiento del tallo, pero no es común su uso.

Acidos nucleicos y compuestos con base de ácidos nucleicos

El ADN, ADN hirolizado no tiene efecto en tejidos bajo cultivo, pero el ERN estimula el crecimiento de callos de tabaco, maravilla y Rumex el efecto del ARN puede ser demostrado en presencia de citocinas.

El uracilo, citosina, guanina, xantina y timina no son efectivos para los callos de zanahoria. Sin embargo, la cinetina y el extracto de zanahoria, que tiene actividad de citocinina, tienen el efecto de estimular el crecimiento cuando se usan con una mezcla de aminoácidos. Por otro lado, la guanina, timina y citosina inducen la formación de órganos en tejidos de tabaco. La mezcla de una citocinina y ácido orótico induce el desarrollo de la inflorecencia de Plumbago índica.

Substancias naturales

Las substancias naturales de las plantas ampliamente usadas son: de agua de coco (10-20%), extractos de levadura (EL) y se emplea en concentraciones de 0.01-0.05%, caseína hidrolizada (CH) se emplea desde 0.01% a 1.0% y extracto de malta (EM) que se adiciona desde 0.1 –0.5% también se usa peptona, jugo de tomate, pepino, del endospermo inmaduro de maíz y ácido casa amino.

Agar

El agar es un gel que se extrae de algas marinas y que por sus características físicas se emplea para solidificar el medio básico, cuando se trabaja con cultivo estsacionario sólido o semi-sólido. Un buen agar es aquel que:

a).- Hierve a 100 °C y que solidifica a 45 °C, aproximadamente. Esta característica le confiere estabilidad a cualquier temperatura de incubación.

b).- No es digerido por enzimas vegetales.

c).- No reacciona con los constituyentes del medio de cultivo

Hay  diferentes  grados  o  tipos  de  agares  y  generalmente  se  le considera como buen soporte del inóculo; sin embargo, datos proporcionados por compañías elaboradoras de agar comercial consignan que contiene pequeñas cantidades de tiamina, biotina y minerales, por lo que no es conveniente utilizarlo indiscriminadamente. Al respecto, White (1953) sugirió que el agar tiene un papel nutrimental, de tal manera que aporta y los tejidos son capaces de utilizar.