SEP SNEST DGEST
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
PRACTICA N.4:
SUBCULTIVO.
(SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)
Que Presentan
Rosalina García Suárez 08930339
Yactivany Atanasio Serrano 08930340
Esbeide de Paz Leonides 08930371
Víctor Manuel Vargas Torres 08930311
Bellanira Pineda Pineda
08930130
Lic. Biología
Ciudad Altamirano, Gro. México.
Marzo del 2012
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CD. ALTAMIRANO
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
PRÁCTICA No.4. SUBCULTIVO.
(SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)
RESUMEN
La presente práctica se
realizó, en el laboratorio de microbiología, localizado en el Instituto
Tecnológico de Cd. Altamirano. Para la iniciar la siembra del material vegetal
fue necesario desinfectar la cámara de flujo laminar con suficiente alcohol,
así mismo los explantes utilizados de Camote de palo (Manihotesculenta) fueron desinfestados con cloralex al 5% durante cinco minutos y dos enjuagues con
agua destilada, el primero durante 1 minuto y el segundo durante 5. La siembra
de los explantes se realizó en la cámara de flujo sobre el medio de cultivo MS.
Los resultados obtenidos no fueron los esperados ya que más del 50% de los cultivos
se contaminaron con hongos y bacterias. Esta
práctica se realizó con la finalidad de sembrar yemas axilares para la
obtención de plántulas inocuas. Concluyendo
que los explantes se infestaron a causa del mal funcionamiento de la cámara
de flujo laminar, aunado también a un error cometido por el docente, ya que
este apagola cámara, la cualdejo de funcionar durante 15 minutos.
Palabras clave:Explantes, esterilización, desinfestar, medio MS,
cámara de flujo laminar, Camote de palo (Manihot
esculenta).
ABSTRAC
This practice was held in the
microbiology laboratory, localizado en el Instituto Tecnologico deCd.Altamirano.Tostart
theplantingof plant materialwasnecessary to disinfectthelaminarflow chamberwith
enough alcohol, likewise the explantsusedwoodenSweet
Potato(Manihot esculenta) were disinfestedwith5%Cloralexfor
fiveminutes and tworinseswith distilled water,thefirstfor 1minute and thesecond
for 5. Planting ofthe explantswas performed inthe flow
chamberonMS medium. The resultsobtained were
notexpectedsince morethan 50% of the cultures were
contaminatedwith fungiand bacteria.This practicewas performed withthe purpose
ofaxillary budsgrowfor obtainingplantletsharmless.Concluding thatthe
explantswere infesteddue tomalfunction of thelaminar flow hood, alsocoupledto a mistake madeby the teacher, for this I turn off thecamera, whichstopped workingfor 15minutes.
Keywords: Explants,
sterilization, disinfest,MS
medium,laminar flow cabinet, Camote de palo (Manihot esculenta).
ÍNDICE PÁGINA.
I. Antecedentes……………………………………………………………………….……….5
II. Definición del
problema………………………………..…………………………………6
III. objetivos……………………………………………………………………………...........7
3.1.Objetivo
general……………………………………….……………………………..........7
3.2.
Objetivo específico………………………………………………………………………..7
IV. Justificación…………………………………………..……………………..……..……..8
V. Fundamento teórico………………………………………………………………………9
5.1Cultivo
in vitro………………………………………………………………………..……...9
5.2
Micro propagación……………………………………………….………………...………9
5.3
Tipo de explantes…………...……………………………………..…………………….....10
5.4
Asepsia de explantes……………………………………...…………..………………......10
5.5
Tapado y sellado de explantes……………………………………..…….…………….......10
V Materiales y métodos…………………………………………………………………….....12
6.1.
Preparación y desinfección de la
cámara de flujo laminar………..………………..........12
6.2.
Introducción y preparación del
material y reactivos a utilizar dentro de la cámara de flujo
laminar…………………………………………………………………….………….....................12
6.3.Desinfestación
y preparación de los explantes……………………………………….........13
6.4.
Siembra de los explantes al medio de cultivos……………………………………….........14
6.5.
Sellado y guardado de los cultivos in vitro…………………………………………….........14
VII. Resultados………………………………………………………………………..…….........15
VII. Conclusiones y recomendaciones………………………………..………………..........21
8.1.
Conclusiones…...…………………………………………………………..…...………….....21
8.2.
Recomendaciones.…………………………………………….……………………….........21
IX. Fuentes consultadas……………………………………………………….….....…….......23
|
|
I. ANTECEDENTES
Estas
técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micro
propagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades,
producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de
embriones, producción de fotoquímicos, estudios básicos de anatomía,
desarrollo, fisiología y nutrición vegetal. El cultivo de tejidos se inicia con
la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente
higiénicas con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los
tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente
estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos
crecerán y se desarrollaran a partir del explante original depende de los
objetivos del cultivo de tejidos, (Hicks
G.S., 1980).
El
cultivo de tejidos in vitro comprende, en su acepción amplia, un heterogéneo
grupo de técnicas mediante las cuales un explante (parte separada de un
vegetal, por ejemplo: protoplastos, célula, tejido, órgano) se cultiva
asépticamente en un medio de composición química definida y se incuba en
condiciones ambientales controladas. Las posibilidades de aplicación de tales
cultivos se pueden resumir así: a) estudios básicos de fisiología, genética,
bioquímica y ciencias afines, b) bioconversion y producción de compuestos
útiles, c) incremento de la variabilidad genética, d) obtención de plantas
libres de patógenos, e) propagación de plantas y f) conservación e intercambio
de germoplasma, ( Roca
w. M., Mroginski l. A., 1991).
Las
técnicas que se emplean para cultivar protoplastos no son exactamente las
mismas que se usan para cultivar meristemos; del mismo modo, un determinado
sistema de cultivo puede ser de gran utilidad para el logro de un objetivo pero
puede ser no útil para otro, (Bonner,
J., 1936).
II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
En
la presente práctica se pretende sembrar yemas axilares de Manihot esculenta en el medio de cultivo MS. Para ello la siembra
debe llevarse a cabo en las mejores condiciones de asepsia y con materiales
esterilizados, así mismo los explantes a sembrar deben encontrarse
perfectamente desinfestados, esto para evitar la contaminación del medio de
cultivo o infestación del explante por hongos y bacterias.
La
amplitud de la definición de cultivo de tejidos y los numerosos objetivos que
estos persiguen constituyen serios escollos en cualquier intento de
generalización sobre los factores que afectan el establecimiento de tales
cultivos in vitro, y obligan a consideraciones previas para delimitar los
alcances de los mismos. Como lo son estrictas medidas de asepsia, tipo de
planta y preparación aséptica de los explantes a utilizar.
III. OBJETIVOS
3.1. Objetivo
general
Realizar siembra de explantes vegetales de (Manihot esculenta)en medios de cultivo- in vitro para la propagación de plántulas.
3.2.
Objetivos específicos
Preparar
y desinfectar la cámara de flujo laminar
Introducción
y preparado del material y reactivos a utilizar dentro de la cámara de flujo
laminar
Desinfestado
y preparado de los explantes
Siembra
de los explantes al medio de cultivos
Sellado
y guardado de los cultivos in vitro
IV. JUSTIFICACIÓN
El
cultivo in vitro es una técnica que permite la propagación de vegetales a
partir de una pequeña porción de planta madre y por resultado se pueden obtener
un gran número de plantas idénticas a la madre, libres de microorganismos y en
un corto periodo de tiempo. Así mismo realizar cultivo de tejidos in vitro de
plantas permitirá al alumno reconocer el manejo apropiado del material vegetal bajo
condiciones estrictas de asepsia y esterilización.Ya que el cultivo in vitro,
necesita condiciones óptimas para su desarrollo y crecimiento, en lo que se
refiere a factores físicos y nutricionales para que no se formen colonias de
bacterias y hongos. El cultivo in vitro es favorable para la multiplicación
masiva de plantas a partir de un pequeño explante, lo cual favorece
directamente a la economía de quien lleve a cabo este proceso.
V. FUNDAMENTO TEÓRICO
5.1 CULTIVO IN VITRO
El
cultivo in vitro se define como el cultivo en un medio nutritivo, en
condiciones estériles, de plantas, semillas, órganos, explantes, tejidos,
células y protoplastos de plantas superiores. (Hanning, 1904)
Estas
técnicas se caracterizan porque:
Ø Ocurren
a micro-escala, sobre todo en una superficie pequeña;
Ø Se
optimizan las condiciones ambientales, en lo que se refiere a factores físicos,
nutricionales y hormonales;
Ø Se
excluyen todos los microorganismos (hongos, bacterias y virus), así como
también las plagas de las plantas superiores (insectos y nematodos)
Generalmente
no se reproduce el patrón normal de desarrollo de una planta, resultando que un
tejido aislado puede dar origen a un callo o puede desarrollarse de otras
formas poco usuales (por ejemplo, formación de órganos, embriogénesis
somática). La capacidad de cultivar protoplastos o células individuales permite
manipulaciones que antes era imposibles. El nombre de cultivo in vitro (que
generalmente quiere decir en vidrio), se utilizó porque, al menos inicialmente,
se usaron recipientes de vidrio para el cultivo(Hanning, 1904)
5.2 Micro propagación
La micro propagación es el
conjunto de técnicas y métodos de cultivo
de tejidos utilizados para
multiplicar plantas asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes
cantidades.Lamicro propagación se utiliza para multiplicar o propagar plantas
nuevas, tales como aquellas creadas porla ingeniería genética, mutagénesiso mejoramiento genético.
Se utiliza también la micropropagación para
obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes
cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.
5.3Tipos de explantes
Los
explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células
sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard, 1999).
El
tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la
especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan.
Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente
muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de
una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el
cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son más bien genéticamente
inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este
procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada
característica de cultivo, pero sí lo es para el fito- mejoramiento, ya que
mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de
cultivo (Fossard, 1999).
5.4 Asepsia de explantes
Una
vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado
para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y
levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y
desarrollo del explante y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo
inservible para cultivo (Kyte&Kleyn, 1996)
Los
explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire
filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un
medio de cultivo apropiado.
5.5 Tapado y sellado de los explantes
Una vez que el explante está en el medio, se
sella el frasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con
condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su
desarrollo.
Una
vez que los explantes, luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento,
han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso
al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que
los explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes
y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de
adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte.Un porcentaje de las
plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si
sobrevive crece en condiciones normales y al cabo de una semana está lista para
ser trasladada al campo de cultivo (Fossard, 1999).
VI.
MATERIALES Y MÉTODOS
La
presente práctica fue realizada el día 13 de marzo del presente año, esta se
desarrolló en el laboratorio de microbiología que se localiza dentro del
instituto tecnológico de cd Altamirano.
La
Cd. Altamirano municipio de Pungarabato, se localiza al noroeste del estado de Guerrero, en la región de Tierra Caliente y en las coordenadas geográficas
18°25’ de latitud norte y los 100°31’ y 100°43’ de longitud oeste. Este
municipio es muy caluroso al experimentar un clima de tipo Cálido Subhúmedo con lluvias en verano
y una temperatura promedio que varía de los 26 a 28 °C. Presenta una
altitud de 241 msnm y una precipitación pluvial promedio de 1000 a 1,100 mm al año.
6.1. Preparación
y desinfección de la cámara de flujo laminar
Para llevar a cabo la presente práctica, antes que nada fueron
repartidas las laboreas a realizar, asignando por el mismo equipo, determinadas
actividades a cada uno de sus integrantes, de tal forma que cada alumno se
encargó de ejecutar los procesos que le correspondían.
Seinició a limpiar la superficie de trabajo en la campana
de flujo laminar, para ello se hizo uso dealcohol y papel higiénico; este
segundo se humedeció con abundante alcohol y sefroto sobre el área de trabajo,
repitiendo una y otra vez el mismo procedimiento hasta cerciorarse de que la
superficie ya se encontraba limpia. Una vez seca el área de siembra, se procedióa
encender la cámara de flujo laminar para iniciar la introducción de cada uno de
los artículos, materiales y reactivos a utilizar dentro de la zona de trabajo.
6.2.Introducción
y preparación del material y reactivos a
utilizar dentro de la cámara de flujo laminar
El
alumno responsable de trabajar en la campana de flujo laminar antes de operar
en ella se esterilizo las manos con suficiente alcohol al 70%, posteriormente
se introdujo en ella una lámpara de alcohol encendida y preparada
anteriormente, así mismo el alumno destinado a trasportar el material estéril
de afuera a una orilla de la cámara de flujo, se esterilizo las manos, mientras
que el operador se encargó de organizar el material dentro del área de siembra,
para ello introdujo los frascos contenedores del medio de cultivo preparados en
la práctica anterior, posteriormente se introdujeron frascos estériles con agua
destilada. Posteriormente se prosiguió a destapar un frasco esterilizado
con agua destilada y le fue retirada la
tercera parte de esta, completando esta después con cloralex al 5%, mientras
que en otro frasco vacío fueron colocadas las pinzas de metal junto con el
bisturí, al cual anteriormente le fue colocada la navaja estéril. Ver figura 1.Ya
listas las sustancias y material necesario para operar dentro del área de
trabajo en la cámara de flujo la minar se prosiguió con la desinfección de los
explantes.
6.3. Des infestación y preparación de
los explantes
Posteriormente
se introdujeron lasporciones de planta de guacamote o camote de palo (Manihotesculenta) a la cámara de flujo
laminar y se vaciaron al frasco con la solución de cloralex al 5%, ahí se
agitaron y se dejaron dúrate 5 minutos, una vez transcurrido el tiempo
establecido se retiró la solución del frasco vaciándola cuidadosamente en un
vaso depresipitados con capacidad de 500ml., evitando dejar salir los explantes
de este. Ver figura 2. Por consiguiente los explantes fueron lavados durante 1
minuto con agua destilada, agregando esta al mismo frasco y agitándolotambién,
así mismo después del minuto estimado el agua fue retirada de este de la misma
forma que en el paso anterior, esto para agregar después por segunda vez agua
estéril y realizar otro lavado de explantes, pero este segundo con una duración
de 5 minutos, de igual forma se retiró el agua dejando solo los explantes sobre
el frasco.
Una
vez desinfectados los fragmentos de planta, estos se sacaron de uno por uno con
las puntas de las pinzas previamente esterilizadas en alcohol y flameadas sobre
la llama de la lámpara de alcohol, estas se fueron colocadas sobre una caja
petri esterilizada. Por segunda ocasión se hizo uso de las pinzas metálicas, las
cuales fueron esterilizadas nuevamente, para ello se sumergieron primero a al
frasco con alcohol y se flamearon sobre el fuego de la lámpara de alcohol, ver
figura 3., este mismo procedimiento se realizó para esterilizar el bisturí, por
consiguiente se esperó a que ambos utensilios se enfriaran y se prosiguió a
cortar el tejido decolorado de los extremos de cada porción de planta, así
mismo fueron cortadas cuidadosamente cada uno de ellas para extraer varios
explantes y evitar dañar la yema axilar, que en este caso fue el explante que
se pretendió propagar. Ver figura 4. Este procedimiento fue realizado para cada
una de las porciones de planta hasta completar los 15 explantes requeridos.
6.4. Siembra de los explantes al medio
de cultivos
Una
vez realizada la desinfección de los explantes de guacamote o camote de palo (Manihotesculenta),se prosiguió a
sembrar cada uno sobre los medios de cultivo preparados en la práctica
anterior, para ello se hizo uso de las pinzas, con las cuales fue tomado el
explante, para ello, estas fueron esterilizadas con alcohol y sometidas a la
flama de la lámpara de alcohol, prosiguiendo de tal forma a tomar con ellas el
explante y abrir un frasco de cultivo para introducir este sobre el medio, así
mismo una vez sembrado el explante sobre el sustrato, se volvió a cerrar el
frasco. Ver figura 5. Este mismo procedimiento se realizó para sembrar los
quince explantes sobre su respectivomedio nutritivo, cabe mencionar que en este
equipo el maestro indicó sembrar tres explantes por integrante.Así que cada uno
se responsabilizó de estos, tomando las medidas adecuadas y condiciones de
esterilidad necesarias para obtener buenos resultados. Los frascos fueron
identificados con la inicial del alumno que lo sembró con la finalidad de
diferenciar los cultivos.
6.5. Sellado y guardado de los cultivos in
vitro
Una
vez sembrados los quince explantes en su respectivo medio, los frascos fueron
sellados uno, por uno, dando tres vueltas con parafilm sobre el borde entre la tapa y el frasco,esto
para evitar la entrada de esporas o microorganismos que pudieran contaminar el
medio. Una vez sellados los frascos estos fueron tomados cuidadosamente por su parte
media y colocados sobre una charola de plástico previamente esterilizada, para
transportarlos al lugar donde fueron incubados.
VII. RESULTADOS
Los
resultados obtenidos en la presente práctica no fueron tan satisfactorios ya
que se presentó un alto índice de contaminación por hongos y bacterias en los
cultivos. Los cuales se atribuyen principalmente a la falla que presenta la
cámara de flujo laminar del laboratorio de microbiología, aunado también a que
facilitador cometió el error de apagar la misma, y el equipo se dio cuenta de
este hecho 15 minutos después, durante los cuales se realizó la disección de
los explantes y siembra de estos en los primeros 4 medios de cultivo.
Cabe
mencionar que los resultados citados a continuación fueron registrados el día
21 de marzo de este año obteniendo 7 cultivos contaminados de 15, de los cuales
4 estaban infestados por hongos y 3 por bacterias, aumentando la cantidad de
medios de cultivo infestados por hongos a ocho para el día 22 de marzo. Figura
6. Los registros y cálculos porcentuales se encuentran registrados en las
tablas 1 y 2, y representados de forma estadística en las gráficas 1y 2.
Tabla 1. Cálculos de los medios de
cultivo contaminados y no contaminados.
DATOS
|
CALCULOS
|
Total de medios de cultivo sembrados: 15
|
15 Cultivos= 100%
|
Cultivos contaminados: 8
|
15
Cultivos 100%
8 Cultivos 53%
|
Cultivos no contaminados: 7
|
15 Cultivos 100%
7 Cultivos 47%
|
Grafica 1. Porcentaje de cultivos
contaminados y no contaminados.
Tabla 2. Cálculos de los medios de
cultivo contaminados tanto por hongos como por bacterias.
DATOS
|
CÁLCULOS
|
Total de medios de cultivo contaminados: 8
|
8Cultivos= 100%
|
Cultivos contaminados por hongos: 5
|
8
Cultivos 100%
5 Cultivos 62.5%
|
Cultivos contaminados por bacterias: 3
|
8 Cultivos 100%
3 Cultivos 37.5%
|
Grafica 2. Porcentaje de medios de
cultivo contaminados por hongos y por bacterias.
Figura 1. Introduccion y preparación
de reactivos dentro de la cámara de flujo laminar:
a) Introducción de los medios de
cultivo a la campana de flujo laminar; b) preparación de la solución cloralex
al 5%.
Figura 2. Desinfección de las
porciones de Manihot esculenta: a) desinfección
de las porciones de planta en cloralex al 5%; b) vaciado de la solución
desinfectante al vaso depresipitados.
Figura 3. Esterilización del material
metálico: a) esterilización de las pinzas de disección por calor seco; b) flameado
del bisturí sobre la llama de la lámpara de alcohol.
Figura 4. Disección del tejido
decolorado de la porción de planta Manihot
esculenta para la extracción de explantes.
Figura 5. Siembra de explantes (yemas
laterales de Manihot esculenta): a)
toma del explante con las pinzas de disección; b) siembra del explante sobre el
medio nutritivo MS.
Figura 6. Medios de cultivo in vitro
de Manihotesculenta contaminados
tanto por hongos como por bacterias.
VIII. CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
8.1.Conclusiones
De acuerdo a los objetivos establecidos en la practica se
pudo conocer el manejo apropiado que se les dio a los explantes que se
sembraron en el medio de cultivo in vitro y cuales deben de ser las medidas de
asepsia que se tiene que llevar a cabo dentro de la cámara de flujo laminar; en
este caso se puede decir que la practica no fue tan satisfactoria debido a que
la cámara estuvo fallando es por ello que hubo un gran porcentaje de
contaminación por lo cual esto hiso que el manipuleo de los explantes a sembrar
se hiciera mucho más difícil teniendo como consecuencia un 53% de contaminación
de los explantes sembrados en el medio de cultivo; ya que estos fueron
colonizados tanto de hongos como de bacterias siendo así esta practica fue como
un ensayo para aprender como se debe de hacer el proceso de la siembra de
cultivos in vitro .
8.2.Recomendaciones
ü Se recomienda que la cámara de flujo laminar funcione
perfectamente ya que de esto dependerá la seguridad de que no se contaminen la
siembra de los cultivos.
ü Se recomienda que la cámara de flujo laminar se limpie
completamente para evitar que haya esporas de hongos o algún tipo de
microorganismos que puedan afectar, antes de proceder con la siembra de los
explantes,
ü Es preferible que cuando se estén manipulando los
explantes se haga de la mejor manera; es decir que el operador que este trabajando
con ello se desinfeste bien las manos con alcohol al 70% para matar cualquier
microorganismo.
ü También es recomendable que se esterilicen bien las
pinzas, el bisturí para evitar la
contaminación de los explantes durante la disección esto se debe de realizar
con las medidas necesarias de saneamiento ya que de esto dependerá el obtener
buenos resultados.
ü Se recomienda que el operador que este frente a la cámara
de flujo laminar tome en cuenta las medida sanitarias que debe de tener para
evitar que los explantes se contaminen para ello la persona que esta haciendo
todo el proceso no debe de meter la cabeza a la cámara de flujo laminar también
debe de evitar el estar hablando, y algo muy importante siempre que se este
realizando la siembra esto se debe de hacer en medio de la cámara así para
evitar que los medios de cultivos in vitro se contaminen tanto de hongos como
bacterias.
IX.
FUENTES CONSULTADAS
Favian.Rojas.@hotmil.com.mx (Kyte & Kleyn
1996 http://cultivo de vegetales. blogspot. Mx /2010/09/ explantes. html).
Asucenaortiz.bio@hotmail.com.mx1999,http://cultivodevegetales.blogspot.mxfe. Consultado 2010/09/ explantes. html).
Bonner, J. 1936. Plant tissue cultures from a hormone
point of view. Proc. Nat. Acad. Sci. 22: 426-430.
Carmen.360@gmail.com.mx
(Fossard 1999,
http://cultivodevegetales.blogspot.mx/2010/09/explantes.html).
Franciscojv@gmail.com.mx
González, Cruz, Camarillo, Silos.
2000, Biotecnología Vegetal (cultivo de tejidos, manual); SEP. 133p.
Hicks G.S. 1980. Patterns of organ development in
plant tissue culture and the problem of organ determination. Bot. Rev. 46: 1-23.
Javier.90@hotmail.com.mx(Fossard.1999,http://cultivodevegetales.blogspot.mx/2010/09/explantes.html).
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Pellón. 1986. La Ingeniería Genética y sus
Aplicaciones. Acribia. México. 237
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ROCA W. M., MROGINSKI L. A. 1991, Cultivo de
tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones. Ed. Centro Internacional de Agricultura Tropical, Colombia.