2.3.- ESTABLECIMIENTO
EL CULTIVO DE TEJIDOS
2.3.1.- ETAPAS DEL
CULTIVO DE TEJIDOS
Etapa
(0) Establecimiento de plantas donadoras de explantes
Etapa
(1) Introducción asepsia (in vitro)
Atapa
(2) Multiplicación
Atapa
(3) Enraizamiento
Etapa
(4) Adaptación al clima
ETAPA (0) ESTABLECIMIENTO DE PLANTAS
DONADORAS DE EXPLANTES
Para
poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener
explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para
obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir
la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar
entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas.
En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un
control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso
y libre de enfermedades.
ETAPA (1) INTRODUCCIÓN ASEPSIA (IN
VITRO)
Luego
de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del
material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de
una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de
nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.
Una
vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales
se obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de hojas,
porciones de raíces, semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará una
desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes
externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que
habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material
vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener las
condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de flujo laminar para extraer
los explantes a partir del material vegetal. Estos explantes se introducirán en
un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación para poder controlar la
sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con
hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluída durante un
período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.
ATAPA (2)
MULTIPLICACIÓN
Durante
esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2 originen
brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada
hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio
de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo
medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados.
Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado
que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el
número de plantas en cada repique o división de las plantas.
El
número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones
del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micro
propagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que
afectan el crecimiento hayan sido optimizados.
ATAPA (3) ENRAIZAMIENTO
Para
enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un
tamaño
aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de
multiplicación
se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga
hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por
esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas
nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren
en forma simultánea.
Manera
que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta
etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la
adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que
se extraen los explantes o plantines enraizados de los frascos, están poco
adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y
crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen
estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua
en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la
humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del
explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele
implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la
barrera física para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie
de la planta.
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