martes, 13 de marzo de 2012

PRÁCTICA N.3: PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES


SEP                      SNEST                      DGEST

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO



PRÁCTICA N.3:
PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Que Presentan
Rosalina García Suárez 08930339
Yactivany Atanasio Serrano 08930340
Esbeide de Paz Leonides 08930371
Víctor Manuel Vargas torres 08930311
Bellanira Pineda Pineda 08930130

Lic. Biología

Ciudad Altamirano, Gro. México.              Marzo del 2012


INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CD. ALTAMIRANO
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
PRÁCTICA No.3.
PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

RESUMEN
La presente práctica se realizó, en el laboratorio de microbiología, localizado en el Instituto Tecnológico de Cd Altamirano. La cual se forjo como objetivo preparar un medio de cultivo MS para cultivo de explantes vegetales. Se preparó un medio de cultivo que contuviera los nutrientes necesarios para permitir el crecimiento de explantes, por tal motivo para la preparación de este se adhirieron al preparado, 3.5ml de cada una de soluciones stock (Nitratos, Sulfatos, Quelatos, PoBoMo, Alógenos y Orgánicos), así mismo se le incorporaron 10.5g de phytagel y 1.05g sacarosa, los cuales fueron aforados a un volumen de 350ml. Obteniendo como resultado un medio de cultivo MS (Murasshine y Skoog), con las características necesarias para el desarrollo adecuado de explantes vegetales.
Palabras clave: Medio de cultivo Murasshine y Skoog, phytagel, sacarosa, pH, probeta.
 ABSTRACT
This practice was held in the microbiology laboratory, located en el Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano. Forged which aimed at preparing an MS medium for plant explant culture. Was prepared in a culture medium containing the necessary nutrients to allow growth of explants, as such for the preparation of this adhered to prepared, 3.5ml of each stock solutions (nitrates, sulphates, chelates, PoBoMo, halogen and organic), also were incorporated into Phytagel 1.05g and 10.5g sucrose, were filled to a volume of 350ml. Which resulted in a MS medium (Murasshine and Skoog) with the characteristics necessary for the proper development of plant explants.

Keywords: Culture medium
Murasshine and Skoog, Phytagel, sucrose, pH probe.
 
ÍNDICE                                                                                                             PÁGINA.
1. Antecedentes……………………………………………………………………………..5
2. Definición del problema………………………………..……………………………….6
3. Objetivos…………………………………………………………………………………..7
    3.1. Objetivo general……………………………………….…………………………..…7
    3.2. Objetivo específico…………………………………………………………………...7
4. Justificación…………………………………………..…………………………………..8
5. Fundamento teórico…………………….…………..…………………………………...9
    5.1. Medio de cultivo……...……………………………………………………………….9
    5.2. Tipos de medios de cultivos…………………………………..………………….....9
    5.3. Clasificación por el uso de los medios de cultivos……..…………………………9
    5.4. Para la preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos..........10
6. Materiales y métodos………………………………………………………………..…11
    6.1. Cálculos para realizar el medio de cultivo a base de soluciones stock……....11
    6.2. Calibrado y pesado de la sacarosa y phytagel………………………………..…11
    6.3. Preparación del medio de cultivo…………………………………………….……12
    6.4. Vaciado y guardado del medio de cultivo……………………………………......13
7. Resultados………………………………………………………………………….....…15
8. Conclusiones y recomendaciones…………………………………………………..21
    8.1. Conclusiones…...…………………………………………………………...………21
    8.2. Recomendaciones.…………………………………………………………..……..21
9. Fuentes consultadas………………………………………………………………..…22

 I. ANTECEDENTES
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos, (Pedrique de Alucio, 1992).
En consecuencia, la nutrición orgánica de las plantas es un tema muy amplio que se extiende desde la nutrición de bacterias y hongos, los variados requerimientos nutricionales de partes aisladas de plantas, los requerimientos especiales de embriones aislados, los tejidos cultivados, las células y protoplastos hasta el tema tan discutido de las plantas superiores obtienen un beneficio especial de las complejas sustancias orgánicas que se encuentran principalmente en el estiércol natural y en las coberturas protectoras. Posiblemente la formación del medio para el cultivo de tejidos es más un arte que una disciplina por derecho público; la experiencia es el mejor maestro para este tipo de trabajo, y este es el mejor consejo u orientación que se le puede dar a un principiante.
Se debería trabajar con materiales que estén definidos con precisión desde el punto de vista taxonómico, genético y del desarrollo; existen muchas evidencias que sugieren que la variación en la respuesta al cultivo de tejidos según el genotipo de la forma como se haga el cultivo, (Krikorian 1990).
 
II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Para propagar plantas in vitro en un laboratorio de tejidos vegetales es necesario formular y preparar medios de cultivo, donde estas puedan crecer y desarrollarse. La preparación de estos conlleva una metodología estricta, exacta y precisa con las concentraciones y cantidades de soluciones stock liquidas o bien con los solutos. El medio nutritivo que se debe preparar deberá estar dotado de las condiciones, nutrientes y requerimientos exactos para asegurar de cierta forma resultados exitosos.
 
III. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
ü        Conocer la preparación del medio MS(Murasshine y Skoog) para el cultivo de tejidos           vegetales.
3.2. Objetivos específicos
Cálculos para realizar el medio de cultivo a base de soluciones stock
Calibrado y pesado de la sacarosa y phytagel
 Preparación del medio de cultivo
 Vaciado y guardado del medio de cultivo
IV. JUSTIFICACIÓN
La preparación de un medio de cultivo para tejidos vegetales es de gran importancia, ya que es este, quien provee las condiciones y nutrientes necesarios al explante para su crecimiento y desarrollo. El uso adecuado de un medio de cultivo para vegetales correctamente preparado con todos y cada uno de sus ingredientes bien medidos y adheridos, favorecerá la producción de plantas in vitro que se requieran propagar ya que es un medio que contiene  los nutrientes y factores de crecimiento necesarios para su óptimo desarrollo.
Al llevar a cabo la presente práctica el alumno se hará acreedor de nuevos conocimientos y experiencias en la formulación y preparación de medios, lo cual contribuirá a su buen desempeño el día de mañana en el ámbito laboral.
V. FUNDAMENTO TEÓRICO
5.1. Medio de cultivo
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los explantes vegetales.Estos medios son esenciales en el Laboratorio de tejidos de cultivo in vitro por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.
(Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992.).
En los laboratorios de cultivo de tejidos se utilizan diferentestipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificantecomo el agar, la gelatina o la sílicagel. (Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992.).
5.2.- Tipos de medios de cultivos
Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química
Definida cualiy  cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación.  (Ortega, Y; Quevedo F. 1991).
5.3.- Clasificación por el uso de los medios de cultivos
Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.
 Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.
Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos. Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles. (Ortega, Y; Quevedo F. 1991).

 5.4.- Para la preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:

ü  Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores.
ü  Que suministren productos de calidad.
ü  Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y físico-Química adecuada.
ü  Utilizar materiales de vidrios bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
ü  Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante. (Ortega, Y; Quevedo F. 1991).
  
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
La presente práctica se desarrolló el día 27 de febrero del presente año en el laboratorio de microbiología,el cual se localiza dentro del instituto tecnológico de cd Altamirano.
La Cd. de Altamirano municipio de Pungarabato, se localiza al noroeste del estado de Guerrero, en la región de Tierra Caliente y en las coordenadas geográficas 18°25’ de latitud norte y los 100°31’ y 100°43’ de longitud oeste. Este municipio es muy caluroso al experimentar un clima de tipo Cálido Subhúmedo con lluvias en verano y una temperatura promedio que varía de los 26 a 28 °C. Presenta una altitud de 241 msnm y una precipitación pluvial promedio de 1000 a 1,100 mm al año.
6.1. Cálculos para realizar el medio de cultivo a base de soluciones stock
Para llevar a cabo la presente práctica, primero que nada el docente indico al grupo que se debía preparar un medio nutritivo con un volumen de 350 ml, de tal forma que cada equipo de trabajo procedió a realizar los cálculos correspondientes para cada elemento del medio a formular. Los cálculos realizados se hicieron de forma ordenada, primero se calculó el volumen de las soluciones stock preparadas en la práctica anterior (nitratos, sulfatos, quelatos, PoBoMo, Alógenos y Orgánicos) ver tabla 1. Posteriormente se realizaron los cálculos en gramos tanto para la sacarosa como para el phytagel, que en este caso fue el gelificante utilizado. Ver tabla 2.
Cabe mencionar que el medio a preparar no incluyo hormonas, aunque también para estas fueron realizados los cálculos correspondientes.

6.2. Calibrado y pesado de la sacarosa y phytagel
Antes de iniciar el pesado del azúcar y del gelificante se calibro la balanza analítica, esto para realizar un pesado preciso y exacto, así mismo se elaboraron dos pequeñas charolas de papel aluminio, sobre las cuales se colocaron los solutos a pesar.
El alumno encargado de realizar el pesado de los nitratos lo hizo cuidadosamente tratando de ser lo más exacto posible, así mismo empleo los cálculos realizados anteriormente para cada una de los elementos. El primer elemento sometido a la balanza sobre la charola de aluminio fue la sacarosa, de la cual se pesaron 10.5g. Por consiguiente fue puesta en ceros nuevamente la balanza analítica, se introdujo la segunda charola de aluminio bacía, se pesó y volvió a poner en ceros la balanza, de tal forma que se prosiguió a pesar 1.05g del gelificante phytagel. Figura 1.
6.3. Preparación del medio de cultivo
Antes de realizar la preparación del medio de cultivo MS, se sacaron las soluciones stock ya preparadas, se colocaron de forma ordenada sobre la mesa de trabajo, el orden fue el siguiente: Nitratos, Sulfatos, Quelatos, PoBoMo, Alógenos y Orgánicos. El orden de estas fue para evitar la confusión al momento de hacer la adición de estas al vaso depresipitados.
Una vez colocadas las botellas contenedoras de las soluciones stock sobre la mesa de trabajo, se colocó una pipeta de vidrio exclusiva de cada  de ellas, posteriormente cada equipo tomo un vaso depresipitados con una capacidad de 500ml, al cual le fueron agregados 100ml de agua destilada, previamente medida en una probeta de plástico. Así mismo se prosiguió a agregar 3.5ml de cada una de las soluciones madre al vaso, haciendo uso de la pipeta individual de cada solución. Ver figura 2.
Una vez adheridas las soluciones stock a la preparación en el vaso depresipitados, se prosiguió a agregar la sacarosa (azúcar morena) y a disolverla, para ello se agito cuidadosamente con una pipeta de vidrio hasta disolverla perfectamente. Figura 3. Una vez disuelta la sacarosa en el medio, este se vació a una probeta de plástico de 1l. Ya contenida la solución en la probeta, el preparado se aforo cuidadosamente a 350ml con agua destilada. Figura 4.
La preparación del medio se vació nuevamente al vaso depresipitados, esto para someterla al peachimetro. Antes de realizar la determinación y regulación de pH de la solución, el peachimetro fue calibrado por el facilitador, el cual hizo uso de soluciones buffer con un pH de 4.0 y otra de 7.0. Ver figura 5. Una vez calibrado el aparato se prosiguió a medir el pH de la preparación, para ello se presionó el botón de standbay y fueron sumergidos los electrodos a la solución, por consiguiente se desactivo el botón standbay y se determinó el pH de esta, el cual fue muy bajo y para elevarlo entre un rango de 5.7 - 6.0 le fue agregado HCl. Ver figura 5. Ya determinado y establecido el pH dentro del rango establecido se retiraron los electrodos del medio y se volvió a activar el botón standbay para que otro equipo prosiguiera con a realizar el mismo proceso.
La solución ya preparada y con un pH adecuado se colocó sobre la plancha eléctrica a una temperatura de 100 ºC, ahí se dejo hasta alcanzar una temperatura entre el rango de 50 – 70 ºC, la cual fue medida con un termómetro de mercurio, ya alcanzado el rango establecido,la temperatura de la plancha se bajó a 40 ºC, posteriormente se agregó el phytagel de forma lenta y cuidadosa, mientras se incorporaba a la solución, al ser agitado con una pipeta de vidrio constantemente, al terminar el vaciado del phytagel se volvió a subir la temperatura a 60 ºC y se dejó ebullir el medio, contando a partir de su ebullición 2 min, para posteriormente retirarlo de la plancha y dejarlo secar sobre un cuaderno en la mesa de trabajo. Figura 6.
6.4. Vaciado y guardado del medio de cultivo
Antes de realizar el vaciado del medio de cultivo fueron etiquetados 15 frascos de vidrio con tapa, utilizando un 16 como referencia, al cual se le agrego 20ml de agua y se selló, esto para hacer un vaciado uniforme del medio en los 15 frascos etiquetados.
El vaciado del medio de cultivo se realizó cuidadosamente, utilizando una franela para evitar quemaduras, por consiguiente fue vaciado el medio en cada uno de los frascos y al finalizar fueron cerrados cada uno con su respectiva tapa. Figura 7.
Una vez llenados y cerrados herméticamente los frascos fueron sellados con plástico para evitar su contaminación, por consiguiente se colocaron en una charola y fueron almacenados enla hielera del refrigerador.
VII. RESULTADOS
Los resultados obtenidos en la presente práctica fueron los esperados, ya que fue posible conocer y realizar el procedimiento de la preparación del medio de cultivo MS de forma exitosa.
Para determinar la cantidad de cada una de las soluciones stock que debían integrar el medio nutritivo a formular, se hicieron los cálculos necesarios. Estos cálculos consistieron en formular 350 ml de medio el cual se formuló a una concentración de 1x, para ello se multiplicaron las cantidades anteriores y fueron divididas entre la concentración (100x) de cada una de las 6 soluciones madre ya preparadas. Tabla 1.
Tabla 1. Cálculos realizados para vaciar las soluciones stock al medio fueron las siguientes:
SOLUCIÓN STOCK
CÁLCULOS
Nitratos
350 ml*1x/100x=3.5ml
Sulfatos
350 ml*1x/100x=3.5ml
Quelatos
350 ml*1x/100x=3.5ml
PoBoMo
350 ml*1x/100x=3.5ml
Alógenos
350 ml*1x/100x=3.5ml
Orgánicos
350 ml*1x/100x=3.5ml

Fue necesario realizar cálculos para adherir al medio azúcar y gelificante, para ello se hizo una regla de tres, donde se multiplico el volumen del medio a preparar (350ml), por 30g de sacarosa que corresponden a la solución en un litro de medio, por ello se buscó obtener la cantidad en gramos de azúcar, de tal forma que el resultado de la multiplicación fue dividido entre 1000ml, obteniendo así la cantidad de azúcar a pesar. Tabla 2. Para calcular la cantidad de phytagel que se debía adherir a la preparación, se siguió el mismo proceso pero multiplicando el volumen del medio por 3g, los cuales corresponden a la solución de gelificante en un litro de medio, lo obtenido de la multiplicación fue dividido entre 1000ml, dando como resultado la cantidad de phytagel que fue agregada al medio. Tabla 2.
Tabla 2. Cálculos realizados para el pesado se sacarosa y phytagel.
SACAROSA
PHYTAGEL
350ml*30g/1000ml=10.5g
350ml*3g/1000ml=1.05g
Una vez realizados los cálculos, de la sacarosa y el phytagel, estos solutos fueron pesados en la balanza analítica.
Figura 1. Calibración y pesado se solutos: a) calibrado de la balanza analítica; b) pesado de 
10.5g de sacarosa; c) pesado de 1.05g de gelificante phytagel.

Al iniciar la preparación del medio de cultivo se colocaron las soluciones madre sobre la mesa de forma ordenada para extraer la cantidad calculada (3.5ml) de cada una de ellas de forma ordenada y agregarlas a la preparación. Figura 2.
 Figura 2. Vaciado de las soluciones stock a la preparación: a) soluciones stock con su respectiva pipeta; b) extracción de la solución stock; c) vaciado de la solución stock a la preparación.
El azúcar se vacío a la preparación y se disolvió agitándose con una pipeta de vidrio. Figura 3.
 
Figura 3. Disolución de la sacarosa a la preparación del medio de cultivo.
Una vez disuelta la sacarosa en la preparación, esta se vació a una probeta de plástico donde fue aforada cuidadosa y exactamente a 350ml. Figura 4.
Figura 4. Aforado de la preparación del medio de cultivo a 350ml.

Para medir el pH del medio nutritivo a preparar se hizo uso del peachimetro, el cual fue calibrado con soluciones buffer de 4 y 7 de pH. Una vez calibrado, se midió el pH del preparado dando como resultado un pH de 4.42, el cual fue estabilizado dentro del rango establecido (5.7-6.0), para ello le fue agregado HCl subiendo el pH a 5.81. Figura 5.


Figura 5. Calibración del peachimetro y medición de pH: a) calibración del peachimetro con buffer de 7; b) peachimetro calibrado; c) medición del pH del preparado; d) adición de HCl para elevar el pH; e); agitado de la preparación con HCl; f) preparación con pH dentro del rango establecido.
 Para realizar la adición del phytagel a la preparación del medio de cultivo, primero que nada se colocó la solución sobre la plancha eléctrica, a la cual se le vació el gelificante poco a poco cuando presento una temperatura de 70 ºC. El gelificante fue disuelto con una varilla de vidrio e incorporado a la solución, posteriormente se dejó ebullir durante dos minutos y se dejó enfriar sobre la mesa de trabajo. Figura 6.

Figura 6. Adición del gelificante al medio de cultivo: a) medición de la temperatura; b) vaciado del phytagel al medio; c) agitado del medio de cultivo para incorporar el gelificante; d) ebullición del medio de cultivo.
El medio de cultivo caliente fue vaciado cuidadosamente a 15 frascos de vidrio previamente etiquetados, para ello se usó una medida de referencia en otro frasco (20ml), esto para hacer un vaciado relativamente uniforme, una vez vaciado el medio, los vasos se cerraron y sellaron para almacenarlos en la hielera del refrigerador. Figura 7.


Figura 7. Vaciado y almacenado del medio de cultivo: a) vaciado del medio de cultivo; b) cerrado de los frascos herméticamente; c) sellado de los frascos; d) almacenado de los medios de cultivo.
VIII.CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
8.1. CONCLUSIONES
Con la realización de la práctica de preparación de medios para el cultivo de tejidos vegetales, se lograron los objetivos establecidos en la misma, proporcionando al alumno gran conocimiento de cómo prepararlo y cuáles son los nutrimentos necesarios de acuerdo a la consistencia que el medio de cultivo obtuvo. Es importante mencionar que se obtuvieron buenos resultados ya que se pudo hacer la preparación del medio sin dificultad alguna.
Una vez realizado el medio de cultivo para vegetales será posible propagar explantes en ellos obteniendo vegetales in vitro.
8.2. RECOMENDACIONES
        Es necesario que cuando se prepare el medio de cultivo para tejidos vegetales se tomen las medidas necesarias para que el preparado tenga las condiciones físicas y químicas necesarias para una buena propagación de cultivos in vitro en un futuro.
         Se recomienda que el phytagel se le agregue a la solución cuando esta se encuentra caliente para que se pueda disolver perfectamente y que este mismo se agregue pausadamente y en pequeñas cantidades.
    Es recomendable que cuando se realicen prácticas o investigaciones se hagan con el cuidadonecesario ya que cuando se le agrega el gelificante se tiene que diluir completamente para evitar que queden grumos en la solución y así obtener una buena preparación de medio para el cultivo de tejidos vegetales.
 

IX.-FUENTES CONSULTADAS 
          Gonzales, cruz, caramillo, silos. 2000. Biotecnología Vegetal. (Cultivo de tejidos, manual)  SEP, México, 133p.
  Pierik R.L. 1991. Cultivo in Vitro de plantas superiores. 1 Ed. Mundiprensa España.
  Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos. 
    Merck. 2002. Microbiology Manual  
   Alimentaria. Organización Panamericana de la Salud. Harla S.A.   México D.F. 
    Prof. Sofía Gutiérrez de Gamboa. 
   Krikorian A.D. 1990. Capítulo 3 Medios de cultivo: generalidades, composición y preparación. Departament of Biochemestry, State University Stony Brook. New York, E.U. 37 p.
      Ortega, Y; Quevedo F. 1991. Garantía de la Calidad de los Laboratorios de Microbiología
Pedrique de Alucio, M. 1992. Microbiología: Manual de medio generales segunda edición. Facultad de Farmacia. Universida

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